雷方玉，王玉芳，叶天太，高 琛，毛梦菌

(衢州市衢江区畜牧兽医站，浙江 衢州 324022)

热应激是指人或动物，在受到比自身能够承受的最高温度之外更高温度刺激时产生的一种非特异性应答反应总和，而这种热应激可能造成人或动物生理功能的改变，常见的包括生殖系统、心血管系统、中枢神经系统功能紊乱等[1]。在畜牧生产过程中，热应激对动物生殖系统的影响更加突出。有研究指出[2]，热应激对可能导致雄性动物睾丸组织细胞损伤，导致生精细胞(GC)凋亡，而使用黄芩苷能在一定程度上防止或减少热应激对生殖系统造成伤害。为研究热应激对动物生殖系统的影响机制，明确黄芩苷在其中的作用，本研究以40只小鼠进行实验，探讨黄芩苷对受热应激小鼠睾丸损伤的保护作用。

1 材料

1.1实验动物 选择40只健康的雄性昆明小鼠，以6～8周龄，体重40 g左右为宜；将其饲养在23 ℃，光暗周期12 h：12 h，定时喂食喂水，饲养1周。

1.2仪器与试剂

1.2.1仪器 Eppendorf Centrifuge 5415D离心机；Bio Photometer生物分光光度计和微量移液器；Applied Biosystems ABI7500荧光定量PCR仪；Sigma 3K-18离心机和1-13离心机；ACCULABA LC-11002电子天平；宁波江南仪器厂提供的恒温恒湿箱HWS；北京君意生产的JY300C电泳仪；北京六一生产的DYCP-31D电泳槽；OLYMPUS SZX12型体视显微镜。

1.2.2试剂 黄芩苷购自北京北纳创联生物技术研究院，TUNEL试剂盒购于南京建成，苏木精CAS#517-28-2购于上海蓝季科技发展有限公司，伊红购于天津博迪化工股份有限公司，中性树胶购于上海国药集团化学试剂有限公司，Bcl-2相关X蛋白基因(Bax，ab182733)和B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2，ab196495)一抗和二抗购自Abcam公司。

1.3处理方法 将40只小鼠随机分成四组，每组10只。A组和C组于腹腔注射0.2 mL/只生理盐水，B组和D组注射0.2 mL的黄芩苷，1次/d，连续处理7 d；第8 d对C组和D组进行热应激处理：设置41 ℃、80%湿度，恒定后将小鼠同时放入恒温恒湿箱中进行热应激处理2 h，期间自由饮水。处理后断颈法处死小鼠，取出睾丸，用生理盐水清洗后置于4%组织细胞固定液中，固定后用流水冲洗6 h，依次用50%、75%、85%、95%、95%、100%、100%乙醇脱水1～1.5 h，再用1∶1二甲苯酒精冲洗30 min，直至边缘透明。放入1∶1苯蜡中50 min，再放入石蜡Ⅰ 2 h、石蜡Ⅱ 1.5 h、石蜡Ⅲ 1 h。按照常规操作将组织块放入包埋盒中，再置于冰箱内快速凝固，完成固定后取出备用。将石蜡切片用二甲苯Ⅰ和Ⅱ脱石蜡各20 min，然后放入1:1二甲苯酒精5 min，再放入无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、95% Ⅰ、95% Ⅱ、90%和80%各级酒精溶液中各5 min，自来水冲洗5 min。将切片在苏木精中染色10～30 min，显微镜下观察染色情况。最后，采用DNA断裂检测试剂盒TUNEL法检测小鼠睾丸生精细胞凋亡指数(AI)，Western blot检测Bax和Bcl-2蛋白表达情况。

2 结果

2.1HE染色结果 A、B、D三组HE染色显示精母细胞(PS)精子细胞(S)、精子(SZ)、睾丸支持细胞(SC)和间质细胞(LC)等细胞形态正常，细胞间排列紧密，组织结构正常完整，但C组小鼠睾丸PS排列疏松，GC核浓缩，呈月牙状，细胞膜皱缩，睾丸间质中出现空泡化。

2.2热应激对小鼠睾丸GC的影响 根据TUNEL检测AI结果显示，A、B两组的凋亡指数(AI)对比，P>0.05；C、D两组AI明显高于A、B两组，而D组AI低于C组，P<0.05，详见表1。

表1 热应激对小鼠睾丸GC的影响

2.3热应激对小鼠Bax、Bcl-2和Bcl-2/Bax的影响 C组Bcl-2和Bcl-2/Bax与A组比较，P<0.05；Bax与A组对比，P>0.05；B、C两组Bax比较，P>0.05；B组Bcl-2和Bcl-2/Bax与C组比较，P<0.05；D组与A组对比，P>0.05，详见表2。

表2 热应激对小鼠Bax、Bcl-2和Bcl-2/Bax的影响

3 讨论

适当的应激刺激能提高动物机体对环境的适应能力和生产性能，但超过某个极限，则可能造成动物生理、心理、行为等多方面的异常活动，严重的甚至造成机体内环境紊乱、组织器官生理功能和机能活动障碍，进一步导致生命健康质量下降[3]。热应激是动物饲养和运输过程中常见的应激，正常情况下，动物对热应激的刺激会通过调节自身体温中枢来适应，促使机体产热和散热处于一个始终平衡的状态[4]。但如果温度过高，超越了动物调节的极限，体内热量聚集而不能很好的散热，导致机体中枢神经调节失常，机体脂质和蛋白分解加快，体内自由基急速增加，而自由基清除不足，就对动物的机体组织造成氧化损伤，影响动物的生产性能和健康[5]。

正常情况下，2～8 ℃是精子存活的最佳温度，但高温会使睾丸温度升高，引发睾丸组织细胞变化，影响精子成熟及存活。急性热应激会致使雄性小鼠睾丸系数发生变化，促进细胞凋亡，生殖细胞和SC减少，影响精子发育能力；热应激会破坏SC的间隙，其连接紧密性降低[6]。从本次研究结果来看，A、B、D三组HE染色显示PS、S、SZ、SC和LC细胞形态正常，细胞间排列紧密，组织结构正常完整；但C组小鼠睾丸PS排列疏松，GC核浓缩，呈月牙状，细胞膜皱缩，睾丸间质中出现空泡化。这说明，热应激会造成精子质量降低，精子输出减少，睾丸内雄性激素合成受到抑制，而黄芩苷单独作用时对小鼠睾丸正常生理功能无影响。雄性小鼠受热应激后，其睾丸组织形态发生变化，GC的细胞核浓缩，呈现月牙状，细胞膜发生皱缩，细胞凋亡指数显著增加，表明热应激能对小鼠睾丸组织造成损伤，诱导AI增加，对热应激造成的损伤做出反应[7]。细胞对热应激的敏感性与细胞发育程度有关，经过有丝分裂和减数分裂的细胞对热敏感，快速增殖的细胞比缓慢增殖的细胞更具有热敏感型，因此，细胞凋亡多集中在曲细精管的PS和精原细胞中。而黄芩苷干预再热应激后，小鼠睾丸细胞凋亡指数减少，表明黄芩苷能够保护小鼠睾丸免受热应激损伤[8]。

同时，根据TUNEL检测AI结果显示，A、B两组AI对比，P>0.05；C、D两组AI明显高于A、B两组，D组AI低于C组，P<0.05。这也提示我们，热应激会导致生精障碍，而生精能力的丧失又与细胞凋亡密切相关，随着阴囊温度升高，可以增加生殖细胞凋亡，造成不可逆的损伤。但黄芩苷可以减轻热应激对睾丸组织的损伤，这可能是因为黄芩苷可以消除体内各种氧自由基，抑制黄嘌呤氧化酶的活性，是一种很好的抗氧化剂；当小鼠受到热应激时会引起ROS继发性氧化应激反应，不饱脂肪酸产生连锁反应，继而生成过氧化脂质，产生大量的氧化中间产物，引起细胞的毒性反应，导致细胞内DNA和蛋白等物质的损伤，对细胞造成伤害，减少细胞的增殖率；黄芩苷可降低MDA、NO含量，提高SOD、CAT、GSH-Px的活力对热应激下小鼠睾丸组织的氧化损伤起到缓解作用，提高生殖系统的抗氧化能力，进而减少生殖系统的氧化损伤[9]。

另外，研究还指出，C组Bcl-2和Bcl-2/Bax与A组比较，P<0.05；Bax与A组对比，P>0.05；B、C两组Bax比较，P>0.05；B组Bcl-2和Bcl-2/Bax与C组比较，P<0.05；D组与A组对比，P>0.05。Bcl-2是细胞凋亡的抑制基因，Bax拮抗Bcl-2抑制凋亡作用，也促进细胞凋亡功能，两者参与线粒体应激诱导的细胞凋亡。热应激可增加SC的凋亡率，通过上调LLC-PK1细胞中Bax的表达来增加Bcl-2与Bax的比例并增加细胞凋亡。ERK1/2信号通路调节内皮细胞对生理和病理刺激的生长和适应，而黄芩苷对受热应激小鼠睾丸损伤的保护作用是通过ERK1/2和PI3K/Akt信号通路来调节的，通过调控Bcl-2和Bax来抑制机体正常细胞的凋亡和肿瘤细胞的增殖，表明黄芩苷对机体正常细胞具有选择保护性，对肿瘤细胞可抑制其生长增殖[10]。同时，研究中发现黄芩苷单独处理小鼠，对于Bcl-2/Bax比值与对照组比较差异不显著，表明黄芩苷对于小鼠睾丸组织及GC的正常生理功能不产生影响，或是影响较小；但黄芩苷干预后的热应激处理结果，表明黄芩苷能显著提高Bcl-2/Bax比值，抑制小鼠睾丸组织GC凋亡。

综上所述，热应激诱导小鼠睾丸组织损伤和GC凋亡，而黄芩苷可对热应激诱导的小鼠睾丸组织损伤及GC凋亡起保护作用，通过抑制ERK1/2信号通路活化和激活PI3K/Akt信号通路，降低Bcl-2/Bax比值，减少热应激造成的小鼠睾丸GC凋亡。