阮怿航 吴亮宇 鲁静 黄秀红 刘丽辰 林金科

摘要：[目的]探索一种绿色、环保、安全、高效的铁观音茶多酚提取新方法，为茶多酚绿色提取提供新的技术参考。[方法]以铁观音成品茶为原料，采用新型绿色溶剂——低共熔溶液提取茶多酚;首先筛选出最优的低共熔溶液提取体系，然后在单因素试验的基础上，通过响应面法优化，研究时间、温度、溶液含水率对提取率的影响，得出最佳提取条件并分析其主要成分;最后通过测定DPPH自由基清除率分析茶多酚的抗氧化能力。[结果]筛选出最适的茶多酚低共熔溶液提取体系为：乳酸一甜菜碱，其次得到最佳单因素提取条件为提取时间40min、提取温度60℃、含水率30%、摩尔比2：1、固液比1：40（g：mL）;响应面优化分析得到最佳提取条件为：时间46.79min、温度62.48℃、溶液含水率32.15%，在此条件下茶多酚提取率为15.42%。通过高效液相色谱分析茶多酚组分，其中没食子酸含量占1.40%，儿茶素类物质占84.99%，其他组分占13.61%。低共熔溶液法提取的茶多酚DPPH自由基半清除浓度（IC₅₀）值73.89ug·mL^-1，比抗坏血酸提高了37.80%。[结论]采用响应面法优化得出的低共熔溶液提取茶多酚最佳工艺条件，可有效提高铁观音茶多酚提取率。

关键词：低共熔溶液;铁观音;茶多酚;抗氧化活性;成分分析

中图分类号：TS 201.2文献标志码：A 文章编号：1008-0384（2020）02-0217-09

0 引言

（研究意义）铁观音原产于福建安溪，属于乌龙茶类，具有滋味醇厚、花香显的品质特点，深受消费者喜爱。茶多酚作为铁观音乌龙茶的主要天然活性产物，是茶叶中主要的功能成分，是一种天然抗氧化剂。茶多酚具有抗氧化、抗诱变、抗辐射、抗菌、清除自由基、吸收紫外线等多种生物活性。因此利用低档茶和茶叶生产过程中的废料提取茶多酚，已然成为近些年国内外“绿色工程”的热门研究项目，在提高茶叶利用率和茶产业附加价值方面具有重要意义。（前人研究进展）目前，茶多酚主要的提取方法有：有机溶剂萃取法、逆流提取法、离子沉淀法、大孔树脂吸附分离法、微波辅助浸提法、超声波辅助浸提法、超临界CO₂萃取法等。这些方法中，有的方法提取率较低，有的方法耗能大、成本高，无法投入大规模生产。低共熔溶液是一种绿色溶剂，通过有机化合物和离子型化合物以氢键形式结合形成;其具有无毒性，可生物降解，相对较低的蒸汽压，高导电性，化学性质稳定，零饱和蒸汽压力，在室温下是液体，表面张力小，扩散系数较大，室温下电导率高等特点，且制备过程简单，原料易得，毒性较低，污染较少，原料充足且价格低廉等优点。近年来，随着材料科学的发展，低共熔溶液在材料科学领域有着广阔的应用前景，成为材料科学领域的热点研究内容之一。崔琦的研究表明采用微波辅助低共熔溶液在提取沙棘中的黄酮物质提取率可达到20.82mg·g^-1;OzturkB采用乙二醇和氯化胆碱的低共熔溶液体系从废橘皮中提取橘皮多酚，提取率为3.16mg·g^-1;李婷婷采用微波辅助低共熔溶液法提取黄芩中的黄酮物质，研究结果表明黄酮物质的提取率为52.27mg·g^-1。（本研究切入点）但目前关于低共熔溶液在茶叶内含活性成分的提取研究国内未见报道。（拟解决的关键问题）本研究通过对比不同体系的低共熔溶液和传统水提取方法的茶多酚提取率，筛选适合的茶多酚提取体系，通过单因素和响应面法，优化茶多酚提取条件，并测定茶多酚的抗氧化活性，为提高茶多酚工业提取效率提供理论依据。

1 材料与方法

1.1试验材料与试剂

铁观音成品茶购于惜缘茶叶有限公司，粉碎后过60目筛，密封备用。

DPPH试剂购于东京化成工业株式会社;乳酸、无水乙醇、无水碳酸钠、柠檬酸、果糖购于国药集团;苹果酸、氯化胆碱、甜菜碱、没食子酸购于麦克林公司;福林酚试剂购于索莱宝公司;乙腈（色谱纯），德国Merck公司;冰醋酸（AR）、抗坏血酸（AR）、甲醇（色谱纯），美国Sigma-Aldrich公司。

1.2仪器与设备

712N可见分光光度计（上海精密科学仪器厂）;艾本德5424R高速离心机（德国制造）;HH-6恒温水浴锅（国华电器公司）;高效液相色谱仪（美国Waters公司）;SY-2230恒温水域摇床（美国精骐公司）;超纯水机（成都艾柯公司）;高速多功能粉碎機（永康市铂欧五金制品有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1低共熔溶液制备 采用水浴加热搅拌的方法制备低共熔溶液，将氯化胆碱/果糖、氯化胆碱/乳酸、甜菜碱/苹果酸、甜菜碱/柠檬酸、甜菜碱/乳酸5种双组分按摩尔比1：2各放人烧杯中，在85℃水浴中搅拌为均一的液体（约60～80min）。

1.3.2低共熔溶液的筛选 准确称取铁观音茶粉（2.00±0.05）g于50mL离心管中，各加入30%含水率的5种自制低共熔溶液，混匀后置于恒温水浴摇床中。提取条件为时间60min、固液比为1：20（g：mL）、温度为60℃，转速为100r·min^-1。提取后趁热抽滤，滤液于4℃保藏待测。

1.3.3茶多酚提取的单因素试验 考察不同因素对茶多酚提取的影响。设置的单因素分别是：提取时间（20、40、60、80、100min）;提取温度（40、50、60、70、80℃）;固液比[1：20、1：30、1：40、1：50（g：mL）];低共熔溶液含水率（10%、20%、30%、40%、50%）;低共熔溶液中氢键受体（HBA）与供体（HBD）的摩尔比（1：1、1：2、1：3、2：1、3：1）。

1.3.4响应面优化茶多酚工艺 在单因素试验的基础上，选取连续变量时间（A）、温度（B）、低共熔溶液的含水率（C）为自变量，茶多酚的提取率（Y）为响应值，根据Box-Behnken中心组合实验原理，设计三因素三水平响应面分析试验。各因素水平设定参见表1.

1.3.5茶多酚含量的测定 铁观音提取液的茶多酚含量测定参照GB/T 8313-2018，略作改动。将提取液稀释200倍后，吸取1mL稀释液于刻度试管中，加入10%的福林酚试剂反应5min后再加入7.5%的碳酸钠溶液，摇匀;室温下反应60min，于765nm波长测定各吸光值。提取率计算参照公式（1）。

提取率=C×V/M×l00% （1）

式中，C为样品中溶液的浓度（mg·L^-1），V为提取液体积（mL），M为茶粉质量（g）。

1.3.6茶多酚类物质HPLC分析

（1）待测液制备

将25mL EDTA（10mg·mL^-1）+0.2g抗坏血酸+50mL乙腈加入500mL容量瓶，用水定容至刻度，制得稳定溶液;茶多酚提取液用稳定溶液稀释10倍后过0.45um膜，制成待测液。

（2）HPLC条件

采用WatersAcquity UPLC HSS T3色谱柱（2.1mm×100mm，RPl81.7um），Acquuy UPLC柱在线过滤器，以色谱图中峰不出现拖尾、基线不漂移和分离度为依据对流动相体系和梯度洗脱设计、分析参数进行评定，流动相条件：A相为9.5%乙腈+0.02%EDTA-2Na+2%冰醋酸，流动相B为80%乙腈+0.02%EDTA-2Na+2%冰醋酸。柱温箱温度：35℃，PDA检测条件：扫描范围200～400mm，特征检测波长：278nm，扫描时间：9min;进样量：2ul.

（3）儿茶素组分含量的计算

通过积分HPLC色谱图中的各组分峰面积，可计算出各个组分的浓度，再乘以相应的稀释系数和体积从而得到儿茶素各个组分的含量。

1.3.7铁观音茶多酚提取液的抗氧化能力測定 采用DPPH自由基清除率评价茶多酚提取液的抗氧化能力。DPPH自由基测定方法参照Xu等的方法，略作改动。将茶多酚提取液稀释成不同的质量浓度梯度（50、100、200、400、800ug·mL^-1）;各取0.2mL稀释液于刻度试管中，以超纯水为空白对照，以不同质量浓度梯度（50、100、200、400、800ug·mL^-1）的抗坏血酸溶液为阳性对照，再加入4.8mL 0.01mmol·mL^-1的DPPH自由基溶液，摇匀后于室温下避光反应30min，在517nnl波长下测定吸光值。按公式（2）计算DPPH自由基的清除率，通过SPSs.17软件计算IC₅₀值。

DPPH自由基清除率/%=1-A_s/A_c（2）

式中：Ac为空白样品的吸光度值，As为加入不同浓度样品后的吸光度值。

1.4 数据处理

采用Excel 2007，SPSSl7.0及Design-Expertl0.0.7进行分析处理，数据以平均值±标准差的方式表示，试验均设3次重复。

2 结果与分析

2.1 低共熔溶液体系筛选

由表2可知，低共熔溶液的茶多酚提取率高于超纯水且在统计学上具有极显著差异（P<0.01）;其中乳酸与甜菜碱组成的低共熔溶液体系多酚提取率最高，为（14.40±0.53）%，相比于传统水提取方法提高了67.29%，且对比其他低共熔溶液体系在统计学上表现为极显著差异（P<0.01）。因此选择乳酸和甜菜碱体系作为后续试验的低共熔溶液体系。

2.2 茶多酚提取的单因素试验

2.2.1提取时间对茶多酚提取率的影响 由图1可知，茶多酚的提取时间在20～40min时提取率呈现上升趋势;在40min之后提取率呈现下降趋势;40min时提取率达到最大，为15.23%，且显著高于（户<0.05）其他提取时间的提取率。综合考虑提取成本和效率，确认最佳提取时间为40min.

2.2.2溫度对茶多酚提取率的影响 由图2可知，当温度为40℃～60℃时，提取率随着温度的增加而增加，温度为60℃时提取率达到最大，为（15.27±0.72）%且显著高于其他温度处理的茶多酚提取率（P<0.05）;当温度进一步增加，提取率随之下降。因此，选择温度60℃為最佳提取条件。

2.2.3低共熔溶液组成摩尔比对茶多酚提取率的影响

由图3可知，当氢键供体（HBD）和氢键受体（HBA）的摩尔比为2：1时提取率最佳为14.67%;而1：2时提取率最低，为（13.81±0.02）%。因此，选取低共熔溶液组成摩尔比2：1为最佳摩尔比条件。

2.2.4低共熔溶液含水率对茶多酚提取率的影响由图4可知，当溶液的含水率为10%～30%，茶多酚的提取率随着含水率提高逐渐增加;当含水率为30%时提取率达到最大，为14.78%，且显著高于其他处理的提取率（P<0.05），当含水率大于30%提取率下降。因此，选择含水率为30%的低共熔溶液进行后续试验。

2.2.5固液比对茶多酚提取率的影响 由图5可知，当固液比为1：20～1：40（g：mL）时，提取率随着固液比的增加而增加;当固液比为1：40（g：mL）时提取率达到最大，为14.74%;当固液比大于1：40（g：mE）时，提取率有所下降。故选取1：40（g：mL）可作为低共熔溶液提取茶多酚的最优固液比。

2.3 铁观音茶多酚提取工艺响应面优化

2.3.1响应面优化方案及结果分析 根据单因素试验结果，固液比和低共熔组分摩尔比这2个因素的变化对茶多酚提取率的影响不具有显著性，故选取提取时间A、提取温度B、低共熔溶液含水率C为自变量，茶多酚的提取率Y为因变量，根据Box-Behnken中心组合设计原理进行响应面优化，具体方案和结果见表3.

利用Design-Expertl0.0.7软件中的Box-Behnken模型对表3中的数据进行多元拟合分析，从而获得茶多酚提取率Y对自变量提取时间A、提取温度B、低共熔溶液含水率C的二次项多元统计分析，建立的二元回归方程为：Y=15.37+0.20A+0.24B+0.32C0.040AB-0.093AC-0.21BC-0.25A²-0.36B²-0.55C²。

通过分析回归方程模型与响应面值之间的关联，其中模型户<0.0001，失拟项的P>0.05，说明模型的预测值和试验数据具有高度的吻合度;相关系数r=0.9841，说明回归方程能够很好地模拟实际曲面;调整系数R²=0.9636，说明有96.36%的响应值变化可以通过该模型来解释。由此可以认为模型与实际有高度的契合度，以此方程为基础的数学模型能够充分反映茶多酚提取率与各个提取工艺参数之间的相关关系。

对模型的二次回归方程进行方差分析，结果见表4.由表4可知，回归方程的一次项A、B、C为显著影响因素且表现为极显著性;二次项A²、B²、C²均表现为极显著性;交互项BC具有极显著性。以铁观音茶多酚提取率为响应值建立的模型具有极显著性（P<0.0001），而误差项不显著，说明模型高度契合，回归方程成立，可以较准确表明各因素与响应值之间的函数关系，因此利用该方程可以对茶多酚提取工艺进行优化。

2.3.2铁观音茶多酚提取的最佳条件确定及验证通过绘制响应面图可以更加深入直观地探讨相关变量之间的交互关系以及变量对响应值的影响趋势。模型的响应曲面图如图6，等高线的形状能表示两个因素之间的相互作用情况。若等高线呈现椭圆形，则两个因素之间存在显著交互作用;若等高线呈现圆形，则两个因素之间的交互作用无显著性。由图6可知，含水率和提取温度对茶多酚的提取率具有显著交互影响;提取时间和提取温度对茶多酚的提取率的交互作用无显著相关。当提取温度、提取时间、含水率增加时，响应值呈现出先增加后减少的趋势。这与单因素试验结果相吻合。

在响应面设计的因素范围内，按照回归模型利用Design-Expert 10.0.7软件分析得出的茶多酚提取最佳条件是：提取时间46.8min，提取温度62.5℃，低共熔溶液含水率32.2%，模型预测最佳提取率为15.46%。为证实预测结果，采用最后确定的提取条件进行3次重复验证，得到实际茶多酚提取率为（15.42±0.20）%，与模型预测相差0.04%。由此可见，应用响应面优化法确定的茶多酚提取条件具有实际应用价值。

2.4 茶多酚提取物主要化学成分分析

采用HPLC分析茶多酚提取物中的各组分物质及其含量，生成的色谱图如图7所示。茶多酚提取液中的主要组分分别是没食子酸（GA）和儿茶素类物质，其中GA占1.40%，儿茶素类物质占84.99%。如图8所示，在儿茶素的7种组分中，EGCG的含量最高，其占儿茶素含量的46.29%，是茶多酚的主要活性成分物质。儿茶素类物质组分的比例：表没食子儿茶素（EGC）：儿茶素（C）：表儿茶素（EC）：表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）：没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）：表儿茶素没食子酸酯（ECG）：儿茶素没食子酸酯（CG）为0.796：0.304：0.393：1.517：0.226：0.034：0.007.

2.5 茶多酚提取液的抗氧化活性

对茶多酚提取液进行DPPH自由基清除率能力测定。如图9所示，当质量浓度为50～200ug·mL^-1时，随着质量浓度的增加，应用水提法和低共熔溶液法提取的茶多酚提取液的DPPH自由基清除率也相應增加，当质量浓度大于200ug·mL^-1之后清除率达到一个平衡状态。两种提取方法得到的多酚提取液的最大清除率基本一致，且仅在800ug·mL^-1比阳性对照Vc略低一些。

IC₅₀值表示DPPH清除率为50%时抗氧化剂的浓度;IC₅₀值越大，表明抗氧化物质的抗氧化能力越低。通过计算分析得出IC₅₀值为：铁观音水提取（64.63ug·mL^-1）<铁观音低共熔溶液提取（73.89ug·mL^-1）-1），由此可知两种提取方法得到的茶多酚提取物的抗氧化能力均强于阳性对照V_c，其中水提取的茶多酚抗氧化能力最强，低共熔溶液提取的茶多酚抗氧化能力较水提取的多酚弱一些。由此表明，低共熔溶液提取的茶多酚具有较强的抗氧化能力，可以通过后续的分离纯化方法制成天然抗氧化产品。

3讨论与结论

茶多酚是茶叶中的主要功能成分，也是茶叶发挥其保健功效的重要成分之一。本研究采用低共熔溶液提取茶叶中的多酚类物质，探讨了不同的低共熔溶液体系、提取时间、提取温度、固液比、低共熔组分的摩尔比对茶多酚提取率的影响。

研究结果表明，不同的低共熔溶液均能提高茶多酚的提取率，但低共熔溶液的体系差异导致提取率的增幅也有所差异。其中，以乳酸-甜菜碱为体系的低共熔溶液的提取率最高（14.40±0.53）%，相比常规提取法提高了67.29%。其主要原因是低共熔溶液对植物细胞壁具有较强的破坏作用，且乳酸一甜菜碱体系的流动性优于其他低共熔体系，能促进茶叶内含物质的溶出;茶多酚的最佳提取pH值为4.5，而以乳酸一甜菜碱组成的低共熔溶液能够为茶多酚提供一个酸性的提取环境，从而提高提取率。在单因素试验中，随着时间和温度的增加，茶多酚提取率呈现出先增加后减少的变化趋势，其中最佳提取时间和温度分别是40min和60℃，说明在一定的范围内，茶多酚的提取率与时间和温度呈正相关关系，但长时间和高温度的条件会导致茶多酚类物质的氧化，从而降低其提取的效率;在一定范围内，随着溶剂的增加，茶多酚的溶出率也有所增加，但溶剂持续增加，会引起部分杂质溶出，导致提取率有所下降，同时持续增加投液量还会造成溶液的浪费和提取成本的增加，故选择最佳固液比1：40（g：mL）;当提取体系中含水率较低时，溶液较为粘稠，不利于溶液和茶粉之间进行接触;而含水率过高，则低共熔溶液体系中的极性增强，破坏了低共熔溶液体系中的化学键，导致提取率呈现下降趋势，因此最佳溶液含水率为30%;随着低共熔溶液体系中甜菜碱摩尔量的增加，溶液的黏稠度和pH值也增加，不利于茶多酚的提取，故最适摩尔比HBA：HBD为2：1.

在单因素试验的基础上，利用Design-Expert 10.0.7软件，应用Box-Behnken设计及响应面分析法对此工艺进行优化分析，建立了低共熔溶液提取茶多酚工艺的三元二次多项式回归模型，该模型拟合度高、重现性好;分析得出3个因素对茶多酚提取率的影响具有极显著性（P<0.01）且他们对茶多酚提取率的影响次序依次为：含水率>温度>时间。通过该模型得出的优化提取工艺条件为：提取时间46.8min，提取温度62.5℃，低共熔溶液含水率32.2%、固液比1：40（g：mL）、低共熔溶液组分摩尔比2：1.此时，通过模型计算得出的提取率为15.46%，验证的提取率为（15.42±0.20）%，与模型得到的提取率高度吻合，表明模型准确、可靠，具有实际参考意义。

通过HPLC分析可知，茶多酚的主要成分是儿茶素类物质，占总含量的84.99%，是茶多酚中的主要功能成分;儿茶素中含量最高的是EGCG，占儿茶素总量的46.29%，高出其他组分含量2-9倍不等;EGCG基团上有着丰富的羟基，有着较强的氧自由基结合的能力，同时儿茶素之间在茶叶加工过程中发生集合反应形成二聚体，因此儿茶素具有很好的抗氧化能力。

DPPH自由基作为一种人工合成的自由基分子，能够高效、稳定地定量分析一种物质的抗氧化能力。茶多酚类物质是天然的抗氧化物，因此探索不同提取方式对抗氧化活性的影響，对之后解决实际生产过程中茶多酚活性的保留问题具有重要的指导意义。对茶多酚提取物进行DPPH自由基清除试验，结果表明在一定浓度下清除率均能达到90%，表明高浓度的茶多酚能够有效清除自由基，具有抗氧化能力;当茶多酚质量浓度为50～200mg·mL^-1时，自由基的清除率呈现快速增长的趋势;当茶多酚浓度大于200g·mL^-1时，自由基的清除率维持在稳定的水平上。由此可见，茶多酚的最佳抗氧化浓度为200g·mL^-1。IC₅₀值体现的是当自由基浓度下降一半时所需的茶多酚浓度，IC₅₀值越小表明抗氧化剂的抗氧化活性越强;对比其IC₅₀值，铁观音水提取<铁观音低共熔溶液提取

综上所述，采用低共熔溶液提取的茶多酚可以显著提高茶多酚的提取率且能够有效保持其抗氧化活性;该研究成果能为茶多酚在食品、保健品等领域的深度开发提供理论依据。