李 卓 孙 强 毛日文

壳聚糖(Chitosan)是一种从海洋水生动物外壳或真菌细胞壁中提取的天然多糖[1]，是甲壳素经脱钙、脱蛋白质和脱乙酰基后的产物[2]。壳聚糖中的高分子多糖是一种线型的天然中性黏多糖，是迄今为止发现的唯一阳离子动物纤维，唯一的碱性多糖[3]。壳聚糖是一种免疫调节剂，可激活豚鼠腹膜的巨噬细胞和中性杀伤细胞，增加抗体生成，提高迟发型超敏反应，增加老鼠的细胞毒性，诱导如白介素、增殖因子和干扰素的细胞分裂[1]。蜂胶是蜜蜂从植物芽孢和树干处采集的树脂，混入蜜蜂上颚腺分泌物和蜂蜡等形成的一种具有芳香味的黏性胶状固形物[4]。蜂胶对机体免疫系统具有广泛的调节作用，国内外对此已做了大量报道，它不但能增强体液免疫，还能促进细胞免疫，蜂胶能有效提高巨噬细胞的活性、吞噬能力和抗氧化能力，降低氧化应激反应，调节细胞因子的分泌；增加自然杀伤细胞的活性；调节多形核粒细胞的活性，控制其增殖，因而可以提高机体的免疫力，使机体免疫功能处于动态平衡的最佳状态[5]。

壳聚糖或蜂胶单独使用增强免疫力作用的报道很多，而关于壳聚糖和蜂胶复配使用增强免疫力的作用尚未见报道。本试验以小鼠为研究对象，研究壳聚糖胶囊对正常小鼠免疫功能的影响。根据《保健食品检验与评价技术规范》[6]，对壳聚糖胶囊进行增强免疫力功能动物实验。

1.材料与方法

1.1 样品 壳聚糖胶囊由某保健食品公司提供，内容物为土黄色粉状，人体推荐量为内容物净重1600mg/(人·日),其中含有壳聚糖1320mg/(人·日)，蜂胶粉280mg/(人·日)。壳聚糖胶囊置于阴凉干燥处保存，供实验用。

1.2 动物 选用上海某实验动物有限公司繁殖的18.0～22.6gF1健康雌性小鼠60只，随机分为4组，每组15只，作为Ⅰ组，进行二硝基氟苯诱导小鼠DTH试验。18.3～22.4gF1健康雌性小鼠60只，随机分为4组，每组15只，作为Ⅱ组，进行小鼠抗体生成细胞及半数溶血值(HC50)试验。18.0～22.6gF1健康雌性小鼠60只，随机分为4组，每组15只，作为Ⅲ组，进行小鼠碳廓清试验。18.6～22.7gF1健康雌性小鼠60只，随机分为4组，每组15只，作为Ⅳ组，进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验。18.8～22.1gF1健康雌性小鼠40只，随机分为4组，每组10只，作为Ⅴ组，进行小鼠ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化、NK细胞活性试验。

1.3 仪器与设备 打孔器、T1000型电子动物称、722型分光光度计、超净工作台、酶标仪、二氧化碳培养箱。

1.4 方法

1.4.1 剂量设定：每人(按60kg体重计)每日推荐量为1600mg，相当于26.7mg/(kg·bw)。分别按人体推荐摄入量5倍、10倍、30倍设计三个剂量组即133mg/(kg·bw)、267mg/(kg·bw)、800mg/(kg·bw)，另设0mg/(kg·bw)组以水(已消毒)代替受试物，经口每日一次给予小鼠相应剂量的受试物，连续灌胃30天后测各项增强免疫力功能指标。小鼠灌胃量为10ml/(kg·bw)。

1.4.2 二硝基氟苯(DNFB)诱导小鼠DTH(耳肿胀法)：参考《保健食品检验与评价技术规范》。

1.4.3 血清溶血素测定：参考《保健食品检验与评价技术规范》。

1.4.4 抗体生成细胞测定(Jerne改良玻片法)：参考《保健食品检验与评价技术规范》。

1.4.5 小鼠碳廓清试验：参考《保健食品检验与评价技术规范》。

1.4.6 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验(半体内法)：参考《保健食品检验与评价技术规范》。

1.4.7 NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶测定法)：参考《保健食品检验与评价技术规范》。

1.4.8 ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验(MTT法)：参考《保健食品检验与评价技术规范》。

1.5 统计学方法 用SPSS 10.0软件对各实验原始数据进行方差齐性检验，满足“方差齐”要求的数据资料，用单因素方差分析和多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理；对非正态分布或方差不齐的数据资料进行适当的变量转换，待满足“正态方差齐”要求后，用转换所得的数据进行统计处理。

2.结果与分析

2.1 样品对小鼠体重的影响 133mg/(kg·bw)、267mg/(kg·bw)、800mg/(kg·bw)组与0mg/(kg·bw)组相比较，差异均无显著性。壳聚糖胶囊对小鼠的体重增长无影响。

2.2 样品对胸腺、脾脏器官的影响 所测定的胸/体比、脾/体比值，133mg/(kg·bw)、267mg/(kg·bw)、800mg/(kg·bw)组与0mg/(kg·bw)组相比较，差异均无显著性。

2.3 样品对DNFB诱导小鼠DTH的影响 由表1结果可见，133mg/(kg·bw)、267mg/(kg·bw)、800mg/(kg·bw)组与0mg/(kg·bw)组相比较，差异均无显著性。

表1 样品对DNFB诱导小鼠DTH的影响

2.4 样品对小鼠血清溶血素形成的影响 由表2结果可见，267mg/(kg·bw)组小鼠血清溶血素含量明显高于0mg/(kg·bw)组。

表2 样品对小鼠血清溶血素形成的影响

2.5 样品对抗体生成细胞(溶血空斑数)的影响 由表3结果可见，267mg/(kg·bw)、800mg/(kg·bw)组小鼠溶血空斑数明显高于0mg/(kg·bw)组。

2.6 样品对碳廓清作用的影响 由表4结果可见，133mg/(kg·bw)与800mg/(kg·bw)组小鼠吞噬指数明显高于0mg/(kg·bw)组。

表3 样品对溶血空斑的影响

表4 样品对小鼠碳廓清作用的影响

2.7 样品对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率及吞噬指数的影响 由表5结果可见，800mg/(kg·bw)组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率显著高于0mg/(kg·bw)组。267mg/(kg·bw)与800mg/(kg·bw)组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬指数显著高于0mg/(kg·bw)组。

表5 样品对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率及吞噬指数的影响

2.8 样品对NK细胞活性的影响 由表6结果可见，800mg/(kg·bw)组小鼠NK细胞活性明显高于0mg/(kg·bw)组。

表6 样品对NK细胞活性的影响

表7 样品对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化的影响

2.9 样品对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化的影响 由表7结果可见，800mg/(kg·bw)组小鼠加ConA孔与不加ConA孔吸光度的差值明显高于0mg/(kg·bw)组。

3.讨论

亚健康状态是指人体处于疾病与健康之间的一种状态。亚健康状态以疲劳、活力减退、免疫力降低为主要临床表现，已经成为危害健康的隐患之一。以慢性疲劳为主要症状的亚健康问题是21世纪威胁人类健康的重大问题，发生率呈逐年增加的趋势。因此，以提高免疫力来预防亚健康为切入点具有非常重要的作用[7]。

大量研究结果表明，壳聚糖可增强机体免疫力，对免疫系统具有多方面的调节作用[8]。壳聚糖具有调解和提高机体免疫力，促进抗体产生和增强机体抗病能力的功能。壳聚糖具有抵抗原性，能使交感和副交感神经取均衡。此外，壳聚糖还能使体液保持正常，从而达到强化体细胞及免疫细胞的目的，提高人体免疫力[9]。蜂胶是一种天然高效的免疫增强剂,能刺激机体的免疫机能，增强巨噬细胞的活力，提高机体免疫力,对预防感冒、癌症、衰老和消除老年斑、色素沉积有良好作用[10]。壳聚糖和蜂胶都具有增强免疫力的作用，因此开发壳聚糖、蜂胶复配的产品有一定的意义。

本试验经口给予小鼠不同剂量的壳聚糖胶囊30天，结果显示，壳聚糖胶囊能增强小鼠碳廓清的能力，提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率及吞噬指数，促进小鼠脾细胞溶血空斑及血清溶血素的形成，能增强脾淋巴细胞的增殖能力，提高NK细胞的活性，因此认为壳聚糖胶囊具有增强免疫力的功能。