孙华林,田奎蓉,贺梦凡,方安才,黄小娥,扎西英派,刘俊林

(西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州 730030)

急性肝损伤可由短期大量摄入超出机体代谢能力的酒精而引起,造成肝脏微循环失调、肝细胞坏死、肝组织纤维化、肝硬化等,同时能介导肝癌的形成[1]。除此之外,酒精的大量摄入还能诱导低血糖、高血压、高血脂等多种急性、慢性疾病的发生[2]。研究表明由于酒精作用下能阻止氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)向还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的转化,引起糖异生异常导致机体脂肪代谢受阻,最终引起肝细胞甘油三酯(TG)大量沉积可导致酒精性脂肪肝(AFL)的形成。组织器官进行大量乙醇氧化代谢还会造成细胞内信号传导通路的紊乱以及对蛋白转录异常[3],对机体造成严重伤害。据统计,因急性肝损伤介导的酒精性肝病(ALD)在世界范围内发病率呈逐年上升趋势,约占全世界疾病导致死亡率的3.8%,发病人群以青年人居多[4]。ALD的发病机制十分复杂,在诸多研究成果中显示,通过大量、连续的饮酒是导致该病的主要因素[5-6],而一次性或者短期大量饮酒导致的急性肝损伤是其主要的发病原因之一。

洛神花学名玫瑰茄(HibiscussabdariffaLinn.),在我国广泛地区均有培植。洛神花成品多添加于各类花果茶与保健类食品中,经冲泡过后,其色泽鲜亮,酸甜可口,带有清新的果香,因而受到广大消费者欢迎。研究表明洛神花有利尿、清除氧自由基与加快脂肪代谢等作用[7],《傣医药》中记载洛神花:“清热解渴,敛肺止咳”,具有降血压、解酒的能力[8],此外洛神花对护肾、降血脂以及抗肿瘤[9-10]均有显著效果。在前期研究中发现洛神花多糖提取物对大鼠急性肝损伤具有良好效果,因此本文选用洛神花多糖提取物对大鼠急性肝损伤模型进行干预,以确定相关剂量效应,分析其作用能力,并对其干预机制进行探讨,以期为洛神花多糖提取物作为良好天然解酒保健品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大鼠 200～250 g Wister大鼠120只，雌雄各半,由中国农业科学院兰州兽医研究所提供(实验动物许可证号:SYXK(甘)2015-0001),其饲养、实验及处死过程遵照实验动物管理条例和福利伦理指南执行;ELISA试剂盒:谷丙转氨酶(ALT)试剂盒、谷草转氨酶(AST)试剂盒、碱性磷酸脂酶(ALP)试剂盒、胆碱酯酶(CHE)试剂盒 上海江莱生物科技有限公司;总蛋白(TP)试剂盒、白蛋白(ALB)试剂盒、球蛋白(GLB)试剂盒与谷胱甘肽(GSH)试剂盒 南京建成生物工程研究所;“红星二锅头(56 °)”(500 mL/瓶) 北京红星股份有限公司;“海王金樽”片(3 g×12) 杭州海王生物工程有限公司;其余试剂 均为国产分析纯。

UV-1800紫外分光光度计 日本岛津公司;N-1100D旋转蒸发器 上海仪电仪器有限公司;Beckman Coulter AU680全自动生化分析仪 美国贝克曼公司;Biotek多功能酶标仪 美国博腾仪器有限公司;FD-1C-50真空冷冻干燥仪 北京博医康实验仪器有限公司;3K30超速低温离心机 Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 洛神花多糖提取物制备 洛神花烘干粉碎后,按料液比1∶100 g/mL,80 ℃加入热水浸提4 h后将提取液浓缩至原体积的1/3,按体积比1∶5 (V/V)加入80%乙醇,3000 r/min离心10 min,重复多次收集沉淀[11],得洛神花多糖粗提物,沉淀用蒸馏水溶解,活性炭脱色后,用Sevage试剂(正丁醇∶氯仿=4∶1,V/V)多次脱蛋白,取上清液,得洛神花多糖提取液[12],40～45 ℃旋转蒸发浓缩,真空冷冻干燥(-60 ℃)至恒重,得到淡红色粉末,装瓶密封于-20 ℃冰箱保存。并采用苯酚-硫酸法测定多糖含量[12],在490 nm处测定吸光度,以葡萄糖标准浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,得到标准曲线,Y=0.0007x-0.0043(R=0.9758),测定所得提取物中洛神花多糖含量为67.21 mg/g。

1.2.2 急性肝损伤模型建立与治疗过程 将 120 只 Wister 大鼠随机分为 7 组,实验组、模型组和阳性对照组大鼠每只灌胃 17.5 mL/kg·d BW 的“红星二锅头(56 °)”[10]持续 7 d,从各组中随机抽取5只大鼠进行病理检查,观察肝脏肿胀情况,即当肝脏细胞边界模糊,胞浆中充满大小不等的脂肪空泡,少数细胞核被挤到一边时,确立模型建立[13]。实验组按照多糖浓度需求配成 1.0、2.0、4.0、8.0 g/kg BW 剂量(分别标记为:1.0 g/kg洛神花组、2.0 g/kg洛神花组、4.0 g/kg洛神花组与8.0 g/kg洛神花组)的洛神花多糖提取物,对各组给予急性肝损伤大鼠进行灌胃,阳对照组给予“海王金樽”10 mg/kg BW灌胃,模型组与正常组给予等量直饮水,持续治疗7 d。

1.2.3 血液学检测采用ELISA法测定 各组血清中ALT、AST、ALP与CHE的活力测定(均为双抗夹心法),使用Beckman Coulter AU680全自动生化分析仪测定血清中TP(双缩脲法)、ALB(溴甲酚绿法)、GLB和GSH(分光光度法)含量,具体操作按照试剂盒测定说明书进行。

1.2.4 大鼠体质量变化 实验期间每天称量大鼠体重,观察大鼠在治疗过程中的体重变化。

1.2.5 大鼠肝脏指数[14]解剖分离完整肝脏,称量大鼠肝脏重量并肝脏指数计算公式:

1.2.6 大鼠肝脏组织切片的观察 戊巴比妥皮下注射麻醉,颈动脉采血[13]后立即处死,快速分离完整肝脏与胃部,进行形态学观察;将肝脏置于4%甲醛溶液中浸泡28 d,取浸泡完全的各组大鼠肝脏长、宽各1 cm左右,厚1 cm左右,水洗12 h以上后进行梯度脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、烘片及HE染色等操作[15],观察大鼠肝脏和胃部病变情况。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 血清中ALT、AST、ALP活力测定结果

如表1所示,模型组大鼠血清中ALT、AST与ALP活力与正常组相比均极显著增高(P<0.01),说明造模成功;1.0～8.0 g/kg洛神花组ALT与模型组相比活力极显著降低(P<0.01),其中2.0～8.0 g/kg洛神花组与正常组相比差异不显著。2.0～8.0 g/kg洛神花组AST与模型组相比活力极显著降低(P<0.01),1.0 g/kg洛神花组AST与模型组相比活力显著降低(P<0.05),1.0～2.0 g/kg洛神花组与正常组相比均有极显著差异(P<0.01),4.0～8.0 g/kg洛神花组AST与正常组相比活力均有显著差异(P<0.05)。1.0～8.0 g/kg洛神花组ALP与模型组相比活力极显著降低(P<0.01),其中1.0～8.0 g/kg洛神花组ALP与正常组相比活力有极显著差异(P<0.01);阳性对照组ALT、AST、ALP较模型组活力均极显著降低(P<0.01);洛神花多糖提取物在4.0 g/kg剂量下能极显著降低急性肝损伤大鼠血清中的ALT、AST和ALP活力,与阳性对照组血清中各项指标均十分接近,但对血清中ALP的调节效果与阳性对照组相比差异仍较大。当肝脏细胞受损时,细胞膜通透性增加,胞浆内的ALT、AST和ALP释放入血液中,在血清中活力大大升高,观测其各项指标变化可以综合判定对肝脏损伤的调节效果[16];经洛神花多糖提取物治疗后血清中ALT、AST、ALP指标活力下降,表示肝细胞损伤减少,肝脏实质损害降低。

表1 血清中ALT、AST和ALP活力Table 1 ALT,AST and ALP activity in serum

2.2 血清中TP、ALB、GLB含量测定结果

如图1所示,1.0～4.0 g/kg洛神花组血清中TP含量与模型组相比均显著降低(P<0.05),阳性对照组血清中TP含量与正常组相比,显著升高(P<0.05),1.0、4.0 g/kg洛神花组血清中TP含量与正常组相比具有显著降低(P<0.05);阳性对照组血清中ALB与正常组相比,显著升高(P<0.05),1.0、4.0 g/kg洛神花组血清中ALB与正常组相比,显著降低(P<0.05)。当肝损伤时肝功能会受到影响,血清中TP和GLB会有一定程度升高[17]。而模型组急性的肝损伤时,GLB和ALB并未明显升高,考虑是肾脏可能出现了部分蛋白质丢失造成,洛神花多糖提取物能在一定程度上改善急性肝损伤大鼠血清中的GLB和ALB升高的情况。

图1 血清中蛋白含量Fig.1 Serum protein content注:#与正常组相比具有显著性(P<0.05);##与正常组相比具有极显著性差异(P<0.01);*与模型组相比具有显著性差异(P<0.05),**与模型组相比具有极显著性差异(P<0.01),图2～图3、图5同。

2.3 血清中CHE活力测定结果

如图2所示,模型组CHE活力与正常组相比极显著降低(P<0.01);4.0～8.0 g/kg洛神花组CHE活力与模型组相比显著增高(P<0.05),阳性对照组血清中CHE活力与模型组相比极显著增高(P<0.01);1.0 g/kg洛神花组CHE活力与正常组相比显著降低(P<0.05)。肝脏实质性细胞损伤时血清中CHE活力会明显下降[18],在洛神花4.0和8.0 g/kg作用下血清中CHE活力有所增高,接近于正常组水平,说明在洛神花多糖的作用下肝脏实质细胞损伤有所减少。

图2 血清中CHE活力变化结果Fig.2 Changes of CHE activity in serum

2.4 血清中GSH含量测定结果

如图3所示,与正常组相比,模型组GSH含量极显著降低(P<0.01),1.0 g/kg洛神花组GSH含量显著降低(P<0.05),其余组均无显著性差异。阳性对照组、4.0～8.0 g/kg洛神花组GSH含量与模型组相比极显著增高(P<0.01),1.0与2.0 g/kg洛神花组GSH含量与模型组相比显著增高(P<0.05);GSH大量存在于肝脏中,具有消除氧自由基对脏器损害的能力[19],当肝细胞抵抗酒精损伤时会大量消耗GSH,导致合成释放入血的GSH含量降低,因此检测血清中GSH能反应肝脏GSH消耗情况,血清中GSH消耗减少,表明肝脏细胞损伤有所降低,在洛神花多糖提取物作用下能减轻肝脏GSH的过度耗竭。

图3 血清中GSH含量Fig.3 GSH content in serum

2.5 大鼠体质量变化情况

如图4所示,在4.0 g/kg洛神花治疗下大鼠体重降低减少情况表现较为明显。其体重随治疗时间增加,但与阳性对照组体重变化差异不明显,模型组体重随治疗时间增加而有所降低,且随时间增加有继续下降趋势,4.0 g/kg洛神花组在治疗过程中体重降低有所减少。正常组体重不断增加。

图4 大鼠体质量改变情况Fig.4 Changes in body weight of rats

2.6 大鼠肝脏指数

如图5所示,与正常组相比,模型组肝脏指数极显著增高(P<0.01),表明肝脏受损严重,肝体肿胀明显;且除1.0 g/kg洛神花组肝脏指数显著增高(P<0.05)外,其余组均无显著性差异;阳性对照组、1.0～8.0 g/kg洛神花组肝脏指数与模型组相比均有极显著降低(P<0.01)。并且4.0、8.0 g/kg洛神花组大鼠肝脏指数降低最为明显。肝脏指数是衡量肝脏肿胀的指标,洛神花治疗各组与模型组相比肝脏指数有所下降,洛神花各剂量组肝体增大肿胀情况不明显,表明肝脏充血水肿有所消退,肝脏局部微循环有所改善。

图5 大鼠肝脏指数变化Fig.5 Changes of liver index in rat

2.7 大鼠肝脏与胃部病变情况

如图6所示，A-1、A-2、B-1、B-2、C-1、C-2中所见,急性肝损伤大鼠经洛神花多糖提取物干预后,肝叶边缘钝圆情况减轻,肝体充血水肿消退,被膜紧张情况减弱,肝脏体积有所减少。

如图6中A-3、B-3、C-3所见，急性肝损伤大鼠经洛神花多糖干预后,胃黏膜组织破损情况减轻,有腺区与无腺区分界清晰,胃黏膜潮红情况有所改善,胃黏膜表面出血情况基本消失。

图6 大鼠肝脏病变与胃部组织溃疡情况Fig.6 Rat liver lesions and gastric tissue ulcers注:A-1为模型组肝脏正面图;A-2为模型组肝脏背面图;A-3为模型组胃内表面图;B-1为4.0 g/kg洛神花多糖提取物治疗组肝脏正面图;B-2为4.0 g/kg洛神花多糖提取物治疗组肝脏背面图;B-3为4.0 g/kg洛神花多糖提取物治疗组胃内表面图;C-1正常组肝脏正面图;C-2为正常组肝脏背面图;C-3为正常组胃内表面图。

在洛神花多糖提取物治疗下肝体肿胀消退,充血情况减轻,说明洛神花多糖提取物能有效降低肝脏充血水肿的情况;同时,胃黏膜潮红消退,黏膜出血情况消失,说明局部溃疡症状有所减轻;可见在洛神花多糖提取物治疗下,能有效缓解肝脏充血水肿和降低胃黏膜充血、潮红、溃疡的情况。

2.8 大鼠肝脏组织切片观察结果

如图7所示,经洛神花多糖提取物干预后,肝细胞肿胀减退,肝窦中无红细胞存在,门管区周围仅有轻微炎性细胞浸润,肝细胞索排列较为清晰。可见在洛神花多糖提取物作用下,肝脏出血、水肿以及肝细胞变性坏死和炎性细胞浸润情况有所改善,肝脏形态结构趋于正常,洛神花多糖提取物对急性肝损伤引起的肝脏组织学病变有良好的干预作用,能够改善局部微环境、增加局部吸收和减少炎性浸润,以保护肝脏免受损伤。

图7 大鼠肝脏组织切片Fig.7 Tissue section of rat liver注:A、a为正常组大鼠肝脏切片(HE,100×;200×);B、b为模型组大鼠肝脏切片(HE,100×;200×);C、c为洛神花多糖提取物4.0 g/kg治疗组大鼠肝脏切片(HE,100×;200×);D、d为阳性对照组大鼠肝脏切片(HE,100×;200×)。

3 结论

本实验以洛神花多糖提取物作为研究对象,针对其多糖提取物质对ALD的干预治疗作用,测定各组血清中ALT、AST、ALP、CHE活力及TP、ALB、GLB、GSH含量变化;计算肝脏指数,体质量变化情况,结合肝脏与胃部黏膜形态学观察与肝脏组织石蜡病理切片观察综合分析。结果显示:在形态学和组织学观察所见洛神花多糖提取物能能有效减轻肝体充血肿胀和降低胃黏膜破溃情况,同时保护肝脏免受因酒精过量摄入而导致的肝脏细胞肿胀变性坏死,减轻局部炎性细胞浸润和肝脏出血情况。洛神花多糖提取物对急性肝损伤大鼠肝脏病变进程具有一定延缓作用,能有效减轻胃黏膜破溃情况,并且存在一定剂量关系,其中,以4.0 g/kg洛神花多糖治疗效果最佳。洛神花多糖干预下与模型组相比能有效降低血清中ALT、AST、ALP活力(P<0.01),延缓肝硬化进程。同时能增强血清中CHE活力(P<0.05),改善血液中GSH过度耗竭(P<0.01)的情况,减轻乙醇氧化代谢对肝脏和机体的损伤。洛神花多糖提取物对急性肝损伤大鼠具有良好的干预治疗作用和保肝能力,具有良好开发应用潜力。