赵骏达 郭春凤 武 欣

（1新疆医科大学第一附属医院妇科中心 乌鲁木齐 830011；2复旦大学附属妇产科医院妇科 上海 200011）

据最新数据统计显示，全球范围内宫颈癌在女性所有类型肿瘤中发生率和致死率均排在第四位，而在女性生殖系统肿瘤中发生率和致死率均为第一［1］。在我国，宫颈癌在女性所有类型肿瘤中发生率为第七位而致死率居第八位，在女性生殖系统肿瘤中发病率和致死率也均为第一位［2］。随着经济水平的提高，宫颈癌在治疗方案上也已有了长足的进步（如手术方式、放化疗等），而分子靶向治疗也已展现出了充满希望的前景，但由于癌症异质性的特点导致这些治疗方案的效果很难再进一步提高［3-4］。目前中国对于术后宫颈癌的分期主要采用国际妇产科联盟制定的FIGO 分期系统，是现有比较简洁并且能对宫颈癌患者的预后和临床治疗做出较为准确指导的一套分期系统。然而，由于宫颈癌异质性的原因，现有证据显示处于同一分期的不同宫颈癌患者之间生存期预后存在很大差异［5］。因此，通过研究将宫颈癌患者的分子信息与现行FIGO 分期系统结合起来或许能提高对宫颈癌患者预后判断的准确性，并改进目前针对宫颈癌的临床治疗方案。

Ras-GTP 酶激活蛋白SH3 结构域结合蛋白1（Ras-GTPase-activating protein SH3 domain bindingprotein1，G3BP1）是 G3BP 家族的成员之一，由于G3BP1 可与RasGAP 的SH3 结构域相结合而于 1996 年被发现［6］。G3BP1 中含有一个高度保守的氨基端核转运子2（N-terminal nuclear transport factor 2）样结构域，此结构域与G3BP1 的二聚化、应激颗粒的组装以及G3BP1 与其他促增殖相关蛋白的结合有关［7-8］。此外，G3BP1 在其羧基端含有一个RNA 识别模体，该模体能特异识别结合mRNA 序列，并通过其依赖磷酸化而活化的RNA 酶活性降解这些 mRNA，包 括 c-MYC、PMP22、ATP5B 和BART 等［9］。已有文献提示，G3BP1 在抗病毒感染和自身免疫性疾病中发挥重要调控作用［10-12］。研究证实，G3BP1 在乳腺癌、结肠癌、头颈部癌、胃癌、胰腺癌和食管癌等恶性肿瘤组织中的表达显著升高，可促进乳腺癌细胞的增殖，增强胰腺癌和肝癌细胞的侵袭能力并促进纤维母细胞进入S 期等［13-17］。在肺癌、结肠癌和食管癌等细胞系中，下调G3BP1 被发现可抑制癌细胞的生长迁移、侵袭并诱导癌细胞凋亡［18-20］。然而，关于 G3BP1 在宫颈癌中的表达和临床意义尚无报道。本文拟通过对我院收治的306例宫颈癌患者进行回顾性分析，探讨G3BP1 在宫颈癌中的表达及其与肿瘤发生发展的相关性。

材料和方法

组织样本收集复旦大学附属妇产科医院2012 年1 月至2013 年8 月的宫颈癌手术标本306例，患者术前均未接受过化疗或放疗。组织标本均为复旦大学附属妇产科医院病理科提供的石蜡标本，且均由病理科医师做出诊断。所收集的临床病例信息包括：年龄、病理类型、肿瘤大小、局部浸润（肌层浸润、宫旁浸润、阴道浸润）、盆腔淋巴结转移和FIGO 分期等。对于患者进行随访的时间为术后1、3、6、12 个月，1 年后每 6～8 个月随访 1 次，通过电话、门诊进行随访。对照正常宫颈组织以及上皮内瘤变组织也由复旦大学附属妇产科医院病理科提供。该研究已获得复旦大学附属妇产科医院伦理委员会批准，本研究中获取实验标本的患者均在术前签署知情同意书，同意将个人的临床、病理资料和手术标本用于科学研究。

组织芯片制备调取宫颈癌组织石蜡组织块对应的HE 染色切片，由病理科医师与妇科医师共同镜检标定切片中的典型区域，并在石蜡组织块上标记对应的预计打孔区域。之后用组织芯片制作器在空白蜡块上打直径1 mm 的孔，制作受体蜡块，并在供体蜡块预先标记的区域内打孔采集1 mm 左右的组织芯。将组织芯放入受体蜡块中形成芯片蜡块，严密固定。置于55 ℃恒温箱中10 min。在石蜡即将完全融化时取出芯片蜡块，置于室温下冷却，使组织芯与受体蜡块融合。之后进行4 μm 连续切片，将切片转移至载玻片上，60 ℃烤片，最后置于4 ℃冰箱保存。

免疫组织化学染色将组织芯片置于二甲苯中脱蜡，并经无水乙醇、95%、80%和70%乙醇梯度水化。TBST 冲洗后，组织芯片放入0.01 mol/L 柠檬酸缓冲液中煮沸，进行抗原修复。之后甩干，滴加适量封闭液防止非特异性染色。G3BP1 一抗（美国Proteintech 公司，13057-2-AP，浓度 1∶100）37 ℃孵育3 h，TBST 缓冲液冲洗后滴加适量一抗增敏剂。再滴加适量辣根过氧化物酶标二抗聚合物，室温孵育10 min。最后DAB 显色液孵育，苏木精衬染，脱水，封片。利用自动扫描显微镜和图像分析系统拍摄免疫组化染色照片。读片由病理科医师独立完成，读片前后均不告知患者的任何信息，读片标准为：（1）目的蛋白染色阳性定义为≥5%肿瘤细胞的胞质内可见棕褐色染色；（2）染色强度评分计0～3 分，0 分为阴性，1 分为弱阳性，2 分为中度阳性，3 分为强阳性；（3）染色范围评分计 0～4 分，0 分为＜5%，1分为 5%～24%，2 分为 25%～49%，3 分为 50%～74%，4 分为75%～100%。最后CES 评分为染色强度评分×染色范围评分。

利用3 个宫颈癌数据集分析宫颈癌和癌旁组织中G3BP1 的mRNA 水平包含宫颈癌和癌旁信息的 GSE6791、GSE7803 和 GSE7410 数据集从 GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi）下载，并提取G3BP1 mRNA 相对表达水平进行分析。

统计学分析通过双尾t检验统计分析两组数据间的差异，通过One-Way ANOVA 统计分析多组数据间的差异。根据免疫组化CES 评分结果和ROC 曲线将宫颈癌患者分为G3BP1 低表达组和G3BP1 高表达组。用χ2检验比较G3BP1 表达水平与临床病理资料的关系。Kaplan-Meier 法绘制G3BP1 低表达和高表达患者的生存曲线，Log-rank检验比较G3BP1 低表达和高表达患者的生存差异。用单因素Cox 回归分析临床病理特征及G3BP1 表达情况对患者预后的影响，将单因素Cox 回归分析中的危险因素纳入多因素Cox 回归分析，分析患者的独立预后因素。ROC 曲线比较TNM 分期与TNM 分期+G3BP1 表达对患者生存情况的预测效果。t检验、One-Way ANOVA、χ2检验、Log-rank 检验、Cox 回归分析由SPSS19.0 软件完成，计算C-index 由 R 3.1.2 软 件 完 成 。

结 果

G3BP1 在宫颈癌组织中的表达情况为了检测宫颈癌组织中G3BP1 的表达水平是否发生变化，我们首先分析了包含癌和癌旁信息的宫颈癌GSE6791、GSE7803 和 GSE7410 数据集，结果显示G3BP1 的mRNA 水平均有上调（图1A）。我们利用包含正常、低/高级别鳞状上皮内病变和宫颈癌的组织芯片，检测G3BP1 的蛋白表达水平。发现G3BP1的蛋白表达水平从低级别鳞状上皮内病变开始增高，并且随着疾病进程有递增的趋势（图1B、1C）。这些结果显示G3BP1 在宫颈癌中表达上调。

G3BP1 表达水平与宫颈癌患者临床病例资料的相关性分析根据免疫组化的CES 评分结果，利用ROC 曲线发现CES 为6 时具有最大的曲线下面积（图2A）。因此，我们以CES 6 作为截断值，将306例宫颈癌患者样本分为G3BP1 高表达组与G3BP1低表达组。利用χ2检验分析宫颈癌组织中G3BP1的表达水平与患者临床病理资料的相关性（表1）。结果显示，G3BP1 的高表达与年龄（P=0.023）、肿瘤大小（P＜0.001）、肿瘤分化（P=0.007）、肌层浸润（P=0.001）、阴道浸润（P＜0.001）、盆腔淋巴结转移（P=0.009）以及FIGO 分期（P＜0.001）相关，而与病理分型和宫旁浸润无显著相关性（表2）。

G3BP1 高表达与宫颈癌患者总体生存率的相关性分析利用Kaplan-Meier Plotter 在线生存预测网 站（http：//kmplot.com/analysis/index.php？p=service & cancer=pancancer_rnaseq）分析 G3BP1 的基因表达水平与宫颈癌患者总体生存的关系，并发现G3BP1 基因的高表达与患者不良预后相关（图2B）。同时我们利用306 位宫颈癌患者的跟踪随访资料，研究G3BP1 的蛋白表达水平与宫颈癌患者总体生存率的关系。通过Kaplan-Meier 分析发现G3BP1 高表达患者的总体生存率显著低于低表达组（图2C）。为了进一步验证G3BP1 的表达水平对不同宫颈癌FIGO 分期患者生存的预测效果，我们根据FIGO 分期将306 名宫颈癌患者分成早期组和进展期组两个亚分期组。由于宫颈癌Ⅲ～Ⅳ期的患者往往已经不能直接进行手术治疗，无法获得组织样本，因此306 位宫颈癌患者的分期仅包含Ⅰa～Ⅱb。我们将 FIGO Ⅰa～Ⅰb 为早期组，FIGO Ⅱa～Ⅱb 为进展期组。通过生存分析发现，在这两个亚分期组中，G3BP1 的表达水平都可以对宫颈癌患者的总生存率结果进行预测（图2D、2E）。这些结果表明，G3BP1 在宫颈癌组织中的高表达可能提示宫颈癌患者的不良预后生存。

图1 G3BP1 在宫颈癌组织中的表达情况Fig 1 Expression of G3BP1 in cervical cancer tissues

G3BP1 表达水平与宫颈癌患者总体生存情况的关系为了探讨各种临床病理因素以及G3BP1表达水平在判断宫颈癌患者总体生存情况中的作用，我们利用单因素Cox 回归进行分析，发现阴道浸润（P=0.011）、FIGO 分期（P=0.003）以及 G3BP1 表达水平（P＜0.001）与宫颈癌患者的预后相关（表3）。将以上与宫颈癌患者生存情况相关的临床病理因素以及G3BP1 表达水平进行多因素Cox 回归分析，发现FIGO 分期以及G3BP1 的表达水平可以作为判断该批宫颈癌患者总体生存情况的独立预后因素（表3）。

G3BP1 表达水平联合FIGO 分期预测宫颈癌患者的生存情况上述结果表明，G3BP1 的表达水平可作为宫颈癌患者的独立预后因素。为探究G3BP1 的表达水平是否能够提高传统FIGO 分期的预后效率，我们对FIGO 分期、G3BP1 的表达水平、以及FIGO 分期联合G3BP1 表达水平制作了ROC曲线进行分析。结果表明，单独G3BP1 表达水平（AUC=0.738，95%CI：0.616～0.860）比单独 FIGO分期（AUC=0.659，95%CI：0.537～0.782）的预后性更好。联合FIGO 分期和G3BP1 表达水平（AUC=0.800，95%CI：0.696～0.904）增加了单独 FIGO 分期对宫颈癌患者预后的预测准确性（图3A）。

此外，联合FIGO 分期和G3BP1 表达水平的一致性指数（Harrell's concordance index，C-index）为0.659，比单独 FIGO 分期的一致性指数（0.589）高（图3B）。同时，单独FIGO 分期预测模型的赤池信息量（akaike information criterion，AIC）为 554.643；当联合G3BP1 的表达水平之后，模型的AIC 会降低到539.083（图3B）。综上，将G3BP1 的表达水平联合传统的FIGO 分期能建立更优的预后模型，更准确地预测宫颈癌患者的生存情况。

表2 306 例宫颈癌患者中G3BP1 表达水平与临床病理资料的相关性分析Tab 2 Correlation between G3BP1 expression and clinicopathological variables of 306 cervical cancer patients

讨 论

虽然随着HPV 疫苗的不断普及，宫颈癌的发病率和死亡率有望得到有效控制，但目前宫颈癌死亡率和发病率依然在全世界范围和我国女性生殖系统肿瘤中排第一位。多数情况下，早期宫颈癌并无症状或仅有非特异症状而不能及时引起注意，所以宫颈癌在发现时往往已处于进展期，从而失去最佳的治疗时机。尽管近几十年来对宫颈癌的治疗有了显著进步，但是宫颈癌患者，尤其是发生淋巴结转移患者的生存预后仍不能令人满意。宫颈癌的发生和发展是由诸多外界和内部因素的改变引起的，而目前预测宫颈癌患者生存预后的体系主要是FIGO 分期系统，其未考虑宫颈癌的异质性，因此在对宫颈癌患者进行生存预后以及制定治疗方案时存在一定缺陷。因此，探索宫颈癌中新的分子标志物对理解肿瘤进展的机制以及改善和制定治疗方案具有重要意义。本研究中，我们发现G3BP1 在宫颈癌中表达上调，G3BP1 高表达可能是宫颈癌患者的独立危险预后因素，因此将G3BP1 作为预后因素对宫颈癌患者的预后进行综合考虑有望提高预测的准确性，从而使治疗方案的制定更为合理。

表1 306 例宫颈癌患者的临床病理资料Tab 1 Clinicopathological variables of 306 cervical cancer patients

图2 G3BP1 的高表达提示宫颈癌患者总体生存的不良预后Fig 2 High G3BP1 expression predicts poor prognosis of cervical cancer patients

表3 临床病理因素与宫颈癌患者整体预后的单因素和多因素Cox 回归分析Tab 3 Univariate and multivariate Cox regression analysis of clinicopathological characteristics influencing the overall survival of cervical cancer patients

图3 G3BP1 表达联合FIGO 分期判断宫颈癌患者预后Fig 3 Combination of G3BP1 expression with FIGO stage predict the overall survival of cervical cancer patients

G3BP1 首次被发现是由于它能与RasGAP 结合而成为Ras 信号通路的下游分子［6］，但最近也有研究结果质疑G3BP1 与RasGAP 之间的结合。已有多篇文献提示G3BP1 可以通过发挥信号调节分子的作用，从而影响肿瘤细胞的增殖、生存和转移。例如，G3BP1 下调可以通过抑制Ras 和下游激酶MEK/ERK 活性来抑制结肠癌HCT116 细胞的生长等［21］。而在乳腺癌细胞中G3BP1 的高表达增强了 由 TGF-β1 诱 导 的 Smad2/3 活 化 ，而 在 被 敲 低G3BP1 的细胞中，Smad2/3 磷酸化低于正常表达水平的细胞［22］。进一步的研究表明，包含 G3BP1 和Smad2/3/4 的复合物激活Smad 靶基因的转录和表达，以促进乳腺癌细胞的上皮间质转化和迁移/侵袭［22］。在肺癌 H1299 细胞中，G3BP1 下调显著抑制细胞Src、FAK 和ERK 的磷酸化，从而抑制了肿瘤细胞的迁移和侵袭能力［19］。在肾癌中，G3BP1 则可以通过上调IL-6 表达来活化STAT3 通路，从而促进肿瘤的进展和肿瘤细胞的上皮间质转化和转移［23］。此外，G3BP1 也能够抑制抑癌基因 p53 的活性。G3BP1 能结合p53 C-端的核定位和输出序列，这种结合可以阻断p53 的核定位，导致p53 异常保留在细胞质中，从而抑制凋亡［24］。最近的研究表明，细胞溶质中长链非编码RNA p53RRA 与G3BP1 相互作用，p53RRA-G3BP1 相互作用将 p53从G3BP1 复合物中置换出来，促使p53 保留在细胞核中，从而启动细胞周期停滞、凋亡等［25］。

mRNA 稳定性在基因转录后调控以及肿瘤发生发展过程中起着重要作用。影响mRNA 稳定性的因素很多，如 5’-末端加帽、3’-末端多聚 A 尾、3’-非翻译区和3’-非翻译区等。已有文献报道，G3BP1 能够通过其C 端的RRM 结合特定的RNA，并在胞嘧啶和腺嘌呤残基之间剪切RNA 以调节mRNA 的稳定性，从而影响多种信号传导途径［26］。研究表明，G3BP1 既可以促进mRNA 的稳定性，如tau mRNA 等，也可以诱导mRNA 的降解，包括BART、CTNNB1、ATP5B、PMP22 和 GAS5 等 。其中，PMP22 是一种生长阻滞特异性基因，抑制PMP22 的表达可促进乳腺癌细胞增殖［27］。而CTNNB1 则是一种重要的癌基因，文献发现G3BP1可与 CTNNB1 的 mRNA 直接结合［28］。wnt3a 可以促进G3BP1 发生精氨酸甲基化，而甲基化的G3BP1可以促进CTNNB1 的mRNA 降解，从而负调节Wnt/β-catenin 通路［28］。

此外，G3BP1 也被报道是应激颗粒的组分，并且对于应激颗粒的组装和形成是必需的［8］。应激颗粒是真核细胞暴露在外界环境刺激下（热休克、病毒感染、氧化应激、紫外线辐射、缺氧等），翻译起始受损时或者受到抑制时在胞质内暂时形成的一种高密度结构［29］。应激颗粒最早在细胞处于高温环境下被发现，并特征性地包含多种小分子量的热休克蛋白。之后研究发现mRNA 和很多核糖体蛋白质都是应激颗粒的组成成分。传统的观念认为，应激颗粒的形成与蛋白质翻译的阻滞有关，在神经轴突细胞中G3BP1 也可以通过抑制mRNA 的翻译阻止神经再生［30］。但近期研究发现，应激颗粒的形成有助于促进mRNA 在细胞局部的聚集并增强某些特定的与细胞生存相关的mRNA 的翻译，因此在肿瘤细胞的生存和耐药过程中发挥重要调节作用［31］。我们的研究发现G3BP1 在宫颈癌组织中表达上调，提示G3BP1 的高表达有助于促进体内应激颗粒的形成以及肿瘤细胞对外界刺激的抵抗，从而促进肿瘤的发生发展。

尽管在我们的研究中已经提出了G3BP1 表达水平在宫颈癌中的临床意义，但在已知的单变量分析中，肿瘤分化、局部浸润和盆腔淋巴结转移等预后因素不显著。因此，这项研究还存在一些局限性，包括：（1）纳入本研究的患者人数依然有限，同时受到手术的限制，中晚期患者的比例较低；（2）本研究所纳入的样本仅从一家单位收集。因此，在后期的工作当中，需要大量、多中心、前瞻性的样本和数据来验证这些结果。此外，G3BP1 除了可以作为判断预后的标志物外，也有可能可以成为肿瘤治疗的靶点。已有研究人员基于RasGAP 与G3BP1 的相互作用设计合成抗肿瘤肽38GAP 和GAP161，发现这两种新的多肽不仅增强了小剂量顺铂等传统抗癌药物的抗肿瘤活性，而且对肿瘤细胞有直接的抑制作用［21，32］。综上，我们的研究发现 G3BP1 高表达可能是宫颈癌患者的独立危险预后因素，并可能参与宫颈癌的发生发展等进程。G3BP1 不仅可以作为判断宫颈癌患者预后的标志分子，还有望作为新的靶点为宫颈癌的临床治疗提供更多的可能方案。