王皓 郭兴莹 张志波 张新萍 冀春红 黄象艳

血小板输注无效（platele ttrans fusion refractoriness, PTR）是指患者在至少连续两次输注ABO血型相合且其中至少一次保存时间在48 h以内的血小板后，血小板计数未见有效提升，临床出血症状未得到明显改善[1]。大约30%～70%患者多次输注血小板制品后会产生血小板抗体，导致同种免疫反应而发生PTR[2]。引起同种免疫反应的血小板抗原分为两类：一类是血小板相关性抗原，包括HLA-Ⅰ类抗原、ABH、Lewis、P抗原等；另一类为血小板特异性抗原（HPA）。HLA抗体是引起免疫性PTR的主要原因，其次是HPA抗体，两种抗体可同时存在[3]。HLA基因和HPA基因频率在不同种族、地域的人群中存在差异[4，5]。本文对1例血小板配型困难的严重PTR患者进行研究。

资料与方法

1 一般资料

1.1 临床资料： 患者，女性，28岁，已婚，育一子，血型为O型，Rh(D)阳性，不规则抗体筛查阴性。临床诊断：重型再生障碍性贫血。患者于2016年10月9日开始出现面黄、乏力并牙龈出血不止、双下肢皮肤瘀斑，血常规显示三系降低，于10月12日入住我院，并于12日与14日各输注1个治疗量O+机采血小板，血小板计数得到有效提升。但当17日、20日再次输注各1个治疗量血小板后，患者血小板计数不升反降。该患者无发热、肝脾肿大、DIC、骨髓移植等，未使用抗生素。10月21日～10月27日，为该患者筛选相容性血小板，未成功。此期间患者血小板计数继续降低，出现痰中带血、阴道出血不止等情况，继续为患者输注随机血小板4个治疗量，于10月27日患者血小板计数降至1×109/L。该患者最终因重型再障并发急性脑出血死亡。

1.2 血小板输注疗效观察：用血小板计数增加校正指数（corrected count increment，CCI）作为判断血小板输注是否有效的指标：CCI=（输注后Plt-输注前Plt）(/L)×体表面积（m2）/输入血小板数（×1011）；体表面积=0.006 1×患者身高（cm）＋0.012 8×患者体重（kg）-0.015 29。若输注ABO相合血小板后24 h CCI＜4.5，判断为血小板输注无效，反之为输注有效[6]。

1.3 主要试剂和仪器：DNA提取试剂盒（TIANamp BloodDNA Kit, Tiangen Biotech CO., LTD, Beijing,China）、MASPAT试剂盒（Sanquin，Netherlands）、LCT细胞板（One Lambda，America）、GTI-PAKPLUS试剂盒(BoFuRui Gene Diagnostics,Beijing, China)、HLA分型试剂盒（Fluogene，Inno-Train Diagnostik GmbH, Kronberg,Germany）、HPA分型试剂盒（Fluogene，Inno-Train Diagnostik GmbH, Kronberg, Germany）。

2 方法

2.1 血小板交叉配型与血小板自身抗体检测：采用固相凝集法进行血小板交叉配型，按照MASPAT试剂盒说明书进行操作。微孔内加入供者血小板，在微孔表面形成单细胞层，加入患者血清与LISS（低离子强度溶液）进行孵育，使患者血清中的抗体与固定的血小板单细胞层结合，洗去未结合的血清成分。加入鼠单克隆抗人IgG和人IgG致敏红细胞后离心，若微孔底部形成一层红细胞，表明结果为阳性，血小板交叉配型不合；若红细胞在微孔板底部形成纽扣状，表明结果为阴性，血小板交叉配型相合。

将上述步骤中供者血小板悬液换为患者自身血小板悬液，其余步骤相同，若微孔底部形成一层红细胞为阳性结果，表明存在血小板自身抗体；若微孔底部形成纽扣状，则不存在血小板自身抗体。

2.2 血清学试验

2.2.1 群体反应性抗体（panel reactive antibodies，PRA）检测：使用美国One Lambda 公司的细胞板(lambda cell tray，LCT)来检测患者PRA值，按照补体依赖性细胞毒方法，将表达不同HLA-I类抗原的淋巴细胞包被Terasaki板并冷冻处理，加入患者血清与补体，根据补体介导的抗原抗体反应原理, 染色后在显微镜下计数死亡淋巴细胞的比例以判断抗体水平。

2.2.2 血小板抗体筛查：使用GTI-PAKPLUS血小板抗体检测试剂盒，按照厂家说明书进行操作，检测患者血清中HPA-1a/1a, 3a/3a, 4a、HPA-1b/1b, 3b/3b, 4a、HPA-5b/5b、HPA-5a/5a、GP-Ⅰb/Ⅸ、GP-Ⅳ、HLA等抗体是否存在。

2.3 基因学检测

2.3.1 血液DNA提取：采集患者静脉血液2 mL于EDTA抗凝管中，使用血液DNA提取试剂盒提取患者血液DNA，严格按照厂家说明书进行操作。提取的DNA用紫外分光光度计检测，DNA浓度为76 ng/μL, OD260/OD280值为1.83。

2.3.2 HLA与HPA基因分型检测：将提取的患者DNA样品用FluoGene法进行HLA与HPA基因分型，分别使用HLA分型试剂盒与HPA分型试剂盒，严格按照厂家说明书进行操作。

结 果

1 血小板输注疗效观察：见表1。

2 血清学检测结果

2.1 群体反应性抗体（PRA）：100%。

2.2 血小板自身抗体：弱阳性。

2.3 血小板抗体筛查：见表2。

3 基因学检测结果

3.1 患者HLA基因分型：HLA-A*30，*33; HLA-B*50，*58。

3.2 患者HPA基因分型：HPA-1aa、2aa、3aa、4aa、5aa、6aa、9aa、15ab。

表1 血小板输注疗效

表2 血小板抗体筛查结果

讨 论

本病例患者住院初期两次输注血小板可有效提升血小板计数，但后续连续两次输注足量ABO同型血小板后，24 h血小板计数不升反降，根据CCI计算数值可确诊为PTR。非免疫性与免疫性因素均可导致PTR的发生，非免疫性因素主要有感染、发热、脾肿大、DIC、骨髓移植等，这些因素可导致输入的血小板质量和活性降低、生存期变短、过度消耗等。免疫性因素包括同种免疫抗体、自身抗体以及药物抗体等[7，8]。该患者治疗过程中未出现发热、肝脾肿大、DIC、骨髓移植等情况，未使用抗生素。出现PTR后，为患者输注保存期在48 h内的ABO同型血小板，血小板计数仍未能有效提升。基本可排除导致PTR的非免疫因素存在，初步考虑该患者发生PTR可能是由于免疫因素引起。

引起PTR的免疫因素以同种免疫抗体为主，其中大部分（约80%～90%）是由HLA-Ⅰ类分子引起的，仅约10%～20%是由HPA引起的[3,9]。若怀疑为HLA抗体导致的输注无效，应首先检测群体反应性抗体PRA。PRA＜20%时，考虑为非免疫因素导致的输注无效；PRA＞20%时，表明有HLA同种免疫存在，应随后进行HLA抗体检测与HLA基因分型[10]。本病例患者PRA值为100%，HLA抗体检测阳性，HLA基因分型为HLA-A*30，*33;HLA-B*50，*58。HLA基因频率在不同种族、地域的人群中存在差异[4，5]。在北方汉族人群中，HLA-A*02、A*11、A*24、A*33、A*30、B*13、B*15、B*51、B*46、B*40、B*58有较高的频率分布，而B*50的基因频率仅为0.78%[4,11]，并不常见。当患者输注不相合血小板后体内会产生血小板抗体，导致输注无效。

HPA抗体常与HLA抗体共存，本病例患者血小板抗体筛查显示体内除HLA抗体外，还存在HPA抗体。中国汉族人群HPA-1、2、4、5、6均以a/a纯合子为主，HPA-3和HPA-15是杂合度较高的两个系统，表型分为a/a、a/b以及b/b三种，山东地区血小板捐献人群中HPA-3a/3b和HPA-15a/15b的比例较高[12-14]。该患者HPA基因型为3aa纯合子，也可导致输注无效的发生。

当患者体内存在血小板自身抗体时，不仅自身血小板遭到破坏，输入的异体血小板也会被破坏。该患者血小板抗体筛查结果均为强阳性，高度怀疑患者产生同种抗体同时合并自身抗体。自身抗体检测的弱阳性结果可能与标本中血小板数量较低有关。

对于同种免疫因素引起的PTR，可通过输注相合血小板来解决。目前，筛选相合血小板的方法主要有三种：①鉴定受血者HLA基因型，选择与受血者HLA基因型相合的血小板；②鉴定受血者HLA抗体的特异性，选择不表达对应抗原的血小板；③血小板交叉配型试验。前两种方法对供体池和试验时间要求较高，本病例患者HLA基因型与HPA基因型并不常见，无法在短时间内为患者找到合适的供者血小板。而血小板交叉配型操作简单、结果易于判读、无需较大仪器设备投入，并且能够同时检测HLA抗体与HPA抗体，广泛用于免疫性PTR患者血小板筛选[15，16]。遗憾的是，三种方法均未能为患者找到相合血小板输注。

目前，临床上多数还是采用随机性ABO同型血小板输注，在发生输注无效后会筛选相容性血小板。本病例患者在发生PTR后难以找到配型相合的血小板，这对我们的日常工作起到了警示作用，对于这种严重PTR患者该如何预防与治疗值得思考。在发生PTR前采用相容性血小板输注可明显降低PTR的发生率，对于高危患者，条件允许的情况下，应该优先考虑采用相容性血小板输注。一旦发生严重的免疫性PTR，难以找到相容供者血小板，临床救治困难。这种情况下，应该转变血小板输注管理模式，不是试图确保配型相合的血小板，而是消除HLA/HPA抗体。可以参考肾移植前HLA抗体阳性患者和自身免疫疾病患者的治疗方案，如大剂量丙种球蛋白静注、利妥昔单抗或者血浆置换等方法[17，18]。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突