胡智成，金涛，费樱

(1.贵州医科大学 医学检验学院，贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学附院 临床检验中心，贵州 贵阳 550004; 3.瑞典哥德堡大学 风湿与炎症医学研究中心，瑞典 41346)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)属于葡萄球菌属，为革兰阳性球菌，是人类重要的致病菌之一，可引起社区或医院性感染，如果未能及时治疗，感染可扩散至周围组织或经菌血症转移至其他器官[1]。金黄色葡萄球菌是导致感染性关节炎最常见的致病菌[2]，该菌可分泌多种毒力因子，血管性血友病因子结合蛋白(von Willebrand factor binding protein，vWbp)是其中之一。vWbp可与血管性血友病因子(von Willebrand factor，VWF)结合引发凝血反应[3]。醋酸去氨加压素(desmopressin，DDAVP)是临床上最常用于治疗轻中度血管性血友病(von Willebrand disease，VWD)的药物[4]，可促进病人血液中的VWF和凝血因子VIII释放,提高血小板功能和机体的凝血功能[5]。本实验采用小鼠感染性关节炎模型[6]来研究VWF在感染性关节炎的发生发展中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1实验动物 NMRI雌性小鼠，6～12周龄，购自荷兰实验室(Envigo，the Netherlands)；VWF基因敲除鼠，6～12周龄，由比利时鲁汶大学血栓研究实验室赠予[7]。小鼠的饲养条件及动物实验伦理均符合瑞典哥德堡动物研究伦理委员会的要求。

1.1.2实验试剂 DDAVP商品名为Minirin，规格为4 g/L，购自Ferring Läkemedel AB 公司(马尔默，瑞典)。

1.1.3实验菌株 实验中用到的金黄色葡萄球菌菌株为野生型(WT Newman)，菌株由德国图宾根大学微生物遗传学实验室提供。菌株用大豆胰蛋白酶肉汤甘油-80 ℃保存，每次实验准备的菌液均定量接种血琼脂平板以进行菌液浓度及细菌存活能力的验证，菌株的处理参照文献[8]。

1.2 实验方法

共有两个独立实验。实验一，研究VWF在感染性关节炎发病中的作用：随机抽取VWF基因敲除鼠(VWF-/-)(n=7)和NMRI小鼠(n=7)分别进行编号设立实验组和对照组，每只小鼠通过尾静脉注射0.3×107CFU的WT Newman菌液。动物采用混养以保证实验组和对照组有相同的饲养条件，每笼5～10只，自由饮水取食。定期监测小鼠的体质量和关节炎的发展情况。10 d后处死小鼠，收集血清以检测细胞因子水平，收集四肢用于影像学检测骨损伤情况，收集肾脏用于评估细菌承载量[9]。实验二，研究在使用DDAVP增加小鼠VWF含量后对小鼠感染性关节炎的影响：随机抽取NMRI小鼠进行编号设立Minirin组(n=13)和PBS组(n=12)，Minirin组每只小鼠腹腔注射Minirin 0.1μg[10]，PBS组注射等量的PBS 1 h后，每只小鼠通过尾静脉注射0.3×107CFU的WT Newman菌液；其余处理与实验一相同。

1.3 观察指标

1.3.1小鼠体质量、存活率和关节炎指数 于实验开始后每日观察小鼠一般情况、记录存活数，且于实验 第3、5、7、10天记录小鼠的体质量，计算体质量变化率=检测体质量(第n天)/原始体质量×100%；评估小鼠的关节炎严重程度，评估标准参照文献[11]，0分为无炎症，1分为轻微的可见肿大和红斑，2分为中等的肿大和红斑，3分为明显的肿大和红斑；关节炎指数统计的是每只小鼠四肢评分总和的均值，关节炎频率是指有关节炎的小鼠数占总数的百分比，多关节炎的定义是指两个或两个以上关节同时有关节炎症状。

1.3.2小鼠双肾脓肿程度和双肾细菌承载量 小鼠处死后，收集双侧肾脏并对其脓肿程度进行评分，标准参照文献[12]。0分为完全健康的双肾；1分为双肾无形状改变，但有1～2处小型脓肿形成；2分为多于2处脓肿，但总面积<75%；3分为大面积的脓肿，且分布面积>75%。评估之后将肾脏研磨用定量的PBS稀释后转种血平板，培养24 h后进行菌落计数并估算双肾的细菌承载量。

1.3.3小鼠四肢的影像学分析 小鼠处死后，收集的小鼠四肢关节用4%福尔马林保存，使用微型CT扫描仪进行扫描，所得图像进行三维立体(3D)结构重建。所用仪器型号为Skyscan1176 micro-CT(Bruker，Antwerp, Belgium)，参数为55 kV、455 mA、0.2 mm铝滤光片，曝光时间47 ms；得到的图像用软件NRECON(版本1.5.1，Bruker)进行3D重构，然后使用软件CT-vox(版本2.4，Bruker)进行分析。每个关节都由两名对实验分组未知的课题组员进行评估：0分，完全健康的关节；1分，有轻度骨破坏；2分，中度骨破坏；3分，明显的骨破坏。骨损伤指数是每个关节评分的均值骨损伤频率是有骨破坏的关节数占总关节数的比例。

1.3.4白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和角质形成细胞衍生的细胞因子(keratinocyte-derived cytokine，KC)检测 使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清中的IL-6和KC，使用试剂为DuoSet ELISA Development Kit(R&D Systems Europe, Ltd)。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 第一阶段实验结果

2.1.1一般情况 随实验进程，实验组和对照组小鼠精神逐渐萎靡，活动量、摄食量减少，出现关节红肿、关节僵直等情况，严重可出现跛行甚至残疾。

2.1.2小鼠体质量变化率、关节炎指数和关节炎发生频率 实验组与对照组小鼠体质量变化率比较，差异无统计学意义(P=0.05)，见图1A；从实验第3天起，实验组小鼠关节炎指数和关节炎频率均明显低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，见图1B和图1C。

注：(1)与对照组相比，P<0.05；(2)与对照组相比，P<0.01。图1 两组小鼠体质量、关节炎指数和关节炎频率的变化Fig.1 The changes of body weight, arthritis index and arthritis frequency in two groups

2.2 第二阶段实验结果

2.2.1小鼠体质量变化率、存活率 两组小鼠体质量在感染后呈持续下降趋势(图2A)；小鼠病死情况于感染后第6天开始出现，最终Minirin组的存活率为76.9%，PBS组的存活率为91.7%，但差异无统计学意义(P=0.4)，见图2B。

图2 Minirin组和PBS组小鼠体质量、存活率、关节炎指数、关节炎频率和多关节炎频率的变化Fig.2 The changes of body weight, survival rate, arthritis index, arthritis frequency, and multiple arthritis frequency in Minirin and PBS groups

2.2.2小鼠关节炎表现、关节炎指数、关节炎频率和多关节炎频率 两组小鼠在感染后第3天开始均出现程度不一的关节炎症状、关节及皮肤表面出现红肿等炎症变化。与PBS组比较，Minirin组关节炎指数、关节炎频率和多关节炎频率较低，但差异无统计学意义(P>0.05)，见图2C、图2D和图2E。

2.2.3小鼠关节影像学检查 Minirin组和PBS组骨损伤指数和骨损伤频率比较，差异无统计学意义(P=0.18)，见图3A。PBS组小鼠骨损伤频率为21.7%，Minirin组为30.1%，两组比较差异无统计学意义(P>0.99)，见图3B。影像学检查显示，Minirin组和PBS组均出现骨损伤表现，与无损伤的关节比较，受损的骨关节可见骨结构不完整，骨质表面粗糙，并有空洞形成，见图4 A～图4E。

图3 Minirin组和PBS组小鼠骨损伤指数和骨损伤频率Fig.3 Bone injury index and frequency of bone injury in Minirin and PBS groups

注： (1)为PBS组小鼠无损伤骨影像学图片，(2)为Minirin组损伤骨影像学图片；A为前掌，B为肩关节，C为髋关节，D为膝关节，E为后脚掌；箭头为骨损伤处。图4 Minirin组和PBS组小鼠的关节影像学表现Fig.4 The joint imaging findings of mice in Minirin and PBS groups

2.2.4肾脏肿胀指数、双肾细菌承载量及小鼠血清中IL-6、KC表达水平 在肾脏的脓肿程度和细菌承载量方面，Minirin组和PBS组比较，差异无统计学意义(P=0.22，P=0.22)，见图5A和图5B。小鼠血清中IL-6、KC的表达水平进行比较，差异无统计学意义(P=0.81，P=0.31)，见图5C。

注： A为肾脏脓肿指数，B为肾脏细菌承载量，C为小鼠血清中IL-6、KC水平。图5 Minirin组和PBS组小鼠肾脏肿胀指数、肾脏细菌承载量及小鼠血清中IL-6、KC水平Fig.5 The kidney swelling index, kidney bacterial load and the levels of serum IL-6 and KC in Minirin and PBS groups

3 讨论

感染性关节炎主要由细菌感染引起，常累及一个或多个关节，以膝关节和髋关节最为常见[13]。因病情进展迅速、死亡率高、愈后差，被认为是最危险的关节疾病之一[14]。其发病机制涉及到固有免疫、获得免疫系统的启动和促炎症因子的激活，最终因一系列复杂的炎症反应导致受感染关节骨损伤及骨质破坏[15]，如果不予及时治疗，数日内将会导致关节的不可逆损伤。

感染性关节炎发病机制的关键是细菌侵入关节，而金黄色葡萄球菌作为最常见的病原菌[16]，通过血源性传播到达关节滑膜是其主要的致病途径[17]。金黄色葡萄球菌的致病力与其产生的凝固酶和毒力因子有关。vWbp一方面可激活凝血酶原，将纤维蛋白原裂解成纤维蛋白，将菌体包裹其中利于抵抗宿主免疫系统的清除[18]；另一方面，vWbp通过与VWF的结合，帮助金黄色葡萄球菌粘附于血管内皮细胞[19]，从而有助于细菌侵入组织。之前有研究显示敲除vWbp基因后将会降低金黄色葡萄球菌的致病力[20]，本实验室近期的实验结果也证明，对比野生型金黄色葡萄球菌，敲除vWbp的菌株对关节炎的致病能力有明显下降，进一步发现vWbp与VWF的结合更是导致感染性关节炎的关键(此部分数据暂未发表)。

因此本文通过DDAVP能够增加体内VWF的释放，以改善机体凝血功能为切入点来研究机体VWF增高后金黄色葡萄球菌毒力因子对感染性关节炎的影响，对于临床的治疗和预后具有一定的指导价值。DDAVP是对天然精氨酸加压素的化学结构进行修饰后人工合成的类似物，它具有类似的生理功能，即能够促进机体血液中的VWF的释放。VWF近年被发现是多种炎性疾病的新的炎症标志物，炎症时由血管上皮细胞迅速释放，它能够直接与白细胞结合或通过募集血小板而使白细胞聚集，从而进一步使炎症反应加重[21]。基于此，机体内的VWF是否是影响感染性关节炎的主要关键因素，以及若在机体内VWF相对较高的前提下，关节炎的发生率是否会相应增高是本次研究的目的。在本研究中，相较于普通小鼠，VWF基因敲除小鼠体质量减轻明显较少，关节炎的发生频率和严重程度都明显降低。说明VWF参与了感染性关节炎的发生发展。那若通过给予小鼠DDAVP增加其体内VWF含量，是否会使关节炎的发生率增加、骨质破坏程度加重？在第二阶段实验中，小鼠接受DDAVP预处理后，无论在关节炎的发生发展，还是骨质损伤和体内促炎症因子的表达水平上均无明显差异，但是可以看出Minirin组在体质量下降率、死亡率及关节的损伤程度上比PBS组要高。说明在感染性关节炎时，病情的发生发展可能与当时体内VWF的浓度在一定的程度上有相关性，这可能与小鼠血浆中VWF与金黄色葡萄球菌分泌的vWbp结合受体内复杂环境所限制，亦或是体内VWF的本底表达量已足够有关。

综上，VWF是影响感染性关节炎的因素之一，且在一定程度上VWF与vWbp的结合对感染性关节炎的发生发展具有一定的影响，但关节炎的病情牵涉到复杂的病理发展过程，因此，要想寻找抗感染治疗的新的可行方向，还需要对其致病的机制和治疗方案进行更深入的研究。