谢鹏, 任真奎, 吕菊, 胡玉梅, 吴昌学*, 禹文峰*

(1.贵州医科大学 分子生物学重点实验室，贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学 地方病与少数民族疾病教育部重点实验室，贵州 贵阳 550004； 3.黔西南州人民医院 检验科，贵州 兴义 562400)

脑卒中是世界上排名第二的死亡原因，严重威胁人类生命健康[1]。脑血管破裂或阻塞引起的大脑缺血再灌注损伤是导致脑卒中的主要原因，缺血再灌注损伤是卒中大脑损伤的一个不可逆性事件。研究表明，缺血再灌注导致的细胞线粒体功能障碍、氧化应激、能量耗竭、氨基酸兴奋性中毒、神经炎症和钙离子负荷超载等过程都参与了缺血再灌注损伤[2-4]，提示缺血再灌注损伤是一个复杂的病理过程。因此，明确缺血再灌注损伤的分子机理对认识脑卒中的发病机制及治疗具有重要意义。自噬体是指细胞内部形成一个包裹胞质成分或衰老细胞器的双层膜泡[5]，自噬体外膜与溶酶体膜融合，形成自噬溶酶体，利用溶酶体内的水解酶降解被包裹的成分，并将降解的小分子物质合成新的细胞成分。正常生理状态下，自噬过程会维持在本底水平以维持细胞的内稳态，但在应激、饥饿等刺激条件下可被诱导至较高的水平[6-7]。细胞内自噬水平的异常调控会导致如癌症、肌肉疾病、代谢疾病、感染和神经退行性疾病等一系列疾病的发生[8-9]；自噬是一个具有双重作用的生理过程，对维持细胞内环境稳态具有积极作用，但异常的细胞自噬调控过程会导致机体出现“自噬性的死亡”[10-11]。近年的研究显示，组织缺血缺氧会导致细胞产生自噬反应，进而调节机体自身的内环境稳态，当自噬功能障碍时又会反过来协同加剧细胞组织坏死[12-14]。目前自噬在缺血再灌注损伤中的作用尚不清楚，因此，本研究通过对氧糖剥夺/复氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)体外构建的缺血再灌注高分化大鼠嗜铬神经瘤细胞(PC12)模型来探讨自噬在缺血再灌注损伤中的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

PC12细胞系购买自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，DMEM培养基(赛默飞世尔科技有限公司)、胎牛血清(美国Gibco 公司)、DMEM无糖培养基(美国Gibco 公司)、磷酸盐缓冲溶液(以色列Biological Industries)、蛋白酶抑制剂(CST)、0.25%胰酶消化液(美国Gibco公司)、双染细胞凋亡检测试剂盒(贝博生物)和ROS检测试剂盒(贝博生物)、ECL-Plus发光液(赛默飞世尔科技有限公司)、PVDF膜(美国Millipore公司)，微管相关蛋白轻链-1A/1B (microtubule-associated protein 1A/1B-light, LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ)、泛素结合蛋白(P62)、自噬相关基因BECN1(Beclin-1)和凋亡分子裂解型胱天蛋白水解酶3 (Cleaved-caspase3)抗体购买自美国CST。

1.2 方法

1.2.1PC12细胞培养及缺血再灌注模型建立 1%双抗+10%FBS+89%DMEM培养基配方传代培养细胞，当细胞密度长至80%～90%时进行传代培养。细胞按2×105/孔密度接种至六孔板内，细胞密度长至70%时进行缺血再灌注模型建立。对合适密度的细胞吸弃原培养基，预冷PBS洗细胞两遍后加2 mL无糖培养基(不含血清)，置于三气培养箱[37 ℃，1%氧气(O2)+94%氮气(N2)+5%二氧化碳(CO2)]进行OGD处理，OGD 4 h后弃原培养基，PBS洗细胞两遍，加高糖培养基2 mL(不含血清),置于正常培养箱(37 ℃，5%CO2)行复氧糖处理以模拟再灌注(reoxygenation)，后于不同时间段(0、6、12、18和24 h)进行后续干预处理。

1.2.2实验分组及干预处理 实验分为正常对照组(Control)、缺氧4 h组(OGD4)、缺氧4 h复氧(OGD4/R)不同时间段组(OGD4+R6、OGD4+R12、OGD4+R18、OGD4+R24)、自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)预处理再缺氧/复氧组(OGD/R+3-MA)。Control组细胞在含正常糖培养基置于正常氧培养箱中培养作为对照；OGD4/R组细胞按上述方法进行培养处理；OGD/R+3-MA组细胞先进行3-MA(2.5 mmol/L)预处理2 h后再行OGD4/R24处理作为药物干预处理组。

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡情况 分组干预处理后的细胞按照说明书操作步骤进行流式分析检测细胞的凋亡水平变化。不含EDTA的胰酶消化细胞后离心收集，预冷PBS洗涤细胞两次，去除PBS后用结合液400 μL悬浮细胞，在悬液中加入Annexin V-FITC染色液5μL，轻轻混匀后避光孵育15 min，再加入PI染色液10 μL轻轻混匀避光孵育5 min，上机流式细胞仪检测细胞凋亡率变化，结果以百分比表示。

1.2.4DCFH-DA荧光探针法检测细胞活性氧(ROS) 收集干预处理后的细胞样本按照操作说明书步骤进行，用不含血清的培养基按照1 ∶1 000的比例稀释活性氧检测探针，离心收集后的细胞用预冷的PBS洗细胞，离心后用按比例稀释的探针1 mL重悬细胞置于37 ℃，5% CO2的培养箱中孵育细胞45 min，其间轻轻颠倒混匀4次，孵育结束后用培养基洗涤细胞两次，1 000 r/min离心收集细胞，最后用培养基0.5 mL悬浮细胞进行上机检测分析，平均荧光强度表示ROS含量，结果以相对Control组的倍数表示。

1.2.5细胞自噬(P62、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ)和凋亡(Cleaved-caspase3)相关分子检测 采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测自噬标志分子LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62、自噬相关基因Beclin-1和凋亡分子Cleaved-caspase3的表达变化。细胞经过干预处理后，吸弃培养基，PBS洗细胞两遍，尽量吸弃PBS后按每孔120 μL的量加裂解液(RIPA)，置于冰上裂解细胞5 min后用细胞刮刀收集细胞至1.5 mL干净的离心管中，于冰上继续裂解20 min后，12 000 r/min离心收集上清至新的干净1.5 mL离心管中。采用BCA蛋白定量试剂盒定量分析蛋白浓度，5×SDS buffer，100 ℃，5～10 min变性蛋白后按每孔30 μg等量上样30 mA恒流电泳分离蛋白，220 mA恒流转膜120 min，转膜结束后5%脱脂奶粉室温封闭膜1.5 h，PBST洗膜5 min后孵育一抗，4 ℃摇床过夜；次日，每10 min 1×TBST洗膜3次,室温孵育二抗2 h,每10 min TBST洗膜3次，ECL-Plus发光液于GeneGnome XRQ曝光，GAPDH作为内参，ImageJ软件进行蛋白定量分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 OGD4 h后复氧不同时间PC12细胞凋亡的影响

与Control组比较，OGD4+R6、OGD4+R12、OGD4+R18和OGD4+R24组诱导了PC12细胞凋亡率明显升高，细胞凋亡率伴随复氧时间的延长而增加，其中OGD4+R24组细胞凋亡率最高，差异均具有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：A为细胞流式图；B为凋亡率柱状图；(1)与control组比较P<0.05。图1 OGD4 h后复氧不同时间对PC12细胞凋亡的影响Fig.1 Effects of apoptosis of PC12 cells on the different time of reoxygenation after OGD 4 h

2.2 OGD4 h后不同复氧时间对PC12细胞ROS的影响

与Control组比较，OGD4、OGD4+R6和OGD4+R12、OGD4+R18和OGD4+R24组诱导ROS升高，细胞 ROS伴随复氧时间的延长而增加，其中OGD4+R24组细胞ROS最高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：A为ROS荧光强度，B为ROS相对表达倍数柱状图；(1)与control组比较,P<0.05。图2 OGD4 h后复氧不同时间对PC12细胞ROS的影响Fig.2 Effects of ROS production of PC12 cells on the different time of reoxygenation after OGD 4 h

2.3 OGD4 h后复氧不同时间对P12细胞P62、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Cleaved-caspase3表达的影响

与Control组比较，OGD4 h后复氧不同时间段(R0、R6、R12、R18和R24 h)组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比率、P62、Beclin-1和C-caspase3的表达均增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。结果显示，OGD4+R24组细胞自噬和凋亡相关分子水平上升最高，因此后续的实验中选择OGD4+R24组作为药物干预的模型组。

注：A为Western blot条带图，B为相对表达量柱状图； (1)与control组比较P<0.05。图3 OGD4 h后复氧不同时间对PC12细胞P62、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和C-caspase3表达的影响Fig.3 Expression of P62,Beclin-1,LC3-Ⅰ,LC3-Ⅱ and C-caspase3 of PC12 cells on the different time of reoxygenation after OGD 4 h

2.4 3-MA减少对OGD/R处理后P12细胞P62、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Cleaved-caspase3表达的影响

与OGD4+R24组比较，OGD/R+3-MA组相关的自噬分子P62、Beclin-1的表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比率以及凋亡分子C-caspase3的表达明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图4。

注：A为Western blot条带图，B为相对表达量柱状图； (1)与OGD/R组比较，P<0.05。图4 3-MA对OGD/R处理后PC12细胞P62、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和C-caspase3表达的影响Fig.4 Effects of 3-MA on OGD/R induced expression of P62,Beclin-1,LC3-Ⅰ,LC3-Ⅱ and C-caspase3

3 讨论

脑卒中主要是由于大脑缺血和缺血后再灌注损伤所导致的疾病。目前，大脑缺血再灌注损伤的分子病理假说主要有以下几个方面：(1)缺血导致的局部血流供应中断和能量耗竭使神经元发生不可逆性的坏死[15]；(2)缺血后再灌注引发的兴奋性氨基酸中毒反应；(3)缺血和再灌注阶段过量生成的自由基(ROS和NO)引发的氧化应激反应[16]；(4)缺血再灌注导致神经细胞发生神经炎症反应[13]；(5)缺血再灌注导致神经细胞线粒体功能障碍，进而引发神经细胞凋亡等几个方面的假说[17]。缺血再灌注损伤复杂的分子机制为脑卒中的预防和治疗带来了困难[18-19]。因此，阐明缺血再灌注损伤的分子机制对脑卒中的预防及治疗具有重要意义。

近年来有研究表明，自噬参与了诸如癌症、代谢类疾病和神经退行型性等疾病的病理过程[20-22]。但是对于其确切的分子机理认识是不清楚的。研究报道，在缺血再灌注心肌的细胞模型上，观察到了自噬水平的异常升高且加剧了心肌细胞的损伤，给予自噬相关的抑制剂可以有效缓解缺血再灌注诱导的细胞损伤[23]。与此相反地，有研究表明，药物或者非编码RNA等在MCAO模型大鼠上可以激活神经细胞自噬并发挥减缓缺血再灌注损伤的作用[24-25]。显然，自噬在缺血再灌注损伤中的确切分子机制是不清楚的，有待更多的实验研究阐释。

本研究PC12细胞运用于经典的OGD/R模型上，探讨不同再灌注时间对细胞损伤和自噬的影响。研究发现，随着缺血后再灌注时间的延长，细胞的凋亡水平和ROS含量是不断增加的，ROS是机体细胞代谢过程产生一类强氧化性物质，机体本身具有清除活性氧的能力，但是过量生成的活性氧会导致机体抗氧化系统障碍，ROS氧化生物有机体细胞的细胞器导致细胞功能障碍，这样的过程对神经细胞而言是致命性的损伤。神经细胞功能障碍是多种神经退型性疾病的主要原因。在缺血后再灌注的不同时间段，本研究检测到自噬的水平是不断增加的，细胞的凋亡水平也是伴随着升高的。自噬标志蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1/GAPDH的比例增加，裂解型的Caspase3表达水平升高，有趣的是，在再灌注的刚开始6 h内，自噬水平升高的同时凋亡水平并没有显著升高，但是随着再灌注的时间延迟，凋亡的水平逐渐升高，并伴随着功能障碍性的自噬出现。据此推测，在再灌注的早期阶段，自噬对细胞发挥着积极地保护作用，但随着后期再灌注时间的延长，自噬功能障碍，自噬小体堆积进而反过来加剧细胞的损伤，导致细胞出现自噬性的死亡，表现为自噬特异性降解的底物分子P62的表达增加。因此，再灌注的后期阶段，本研究给予自噬特异性的抑制剂3-MA预处理，结果显示，3-MA可以有效降低缺血再灌注诱发的细胞凋亡，减少细胞的自噬水平。

综上所述，本次研究发现，缺血再灌注的后期阶段(18～24 h)诱导PC12细胞发生自噬性的死亡，表现为细胞凋亡水平升高，自噬标志蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ翻转的比率增加，自噬特异性降解底物P62表达堆积；特异性自噬抑制剂3-MA可以显著降低缺血再灌注后期阶段诱导的自噬水平并减少再灌注诱导的凋亡水平升高。