刘 蔚常 杰武毅君* 马云峰

1. 河南大学第一附属医院，河南 开封 475000; 2. 河南大学 药学院，河南 开封 475004; 3. 河南大学 生命科学学院，河南 开封 475004

健骨痛消丸含有杜仲、熟地、枸杞子、山茱萸、淫羊藿等成分，具有补益肝肾、软坚散结、活血止痛等功效。杜仲科植物杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)是我国传统中药，具有抗肿瘤、降血压、抗菌、抗血栓等药理作用，其干燥树皮，具有补肝肾强筋骨、安胎之功，用于肾虚腰痛，筋骨无力等病症[1-4]。我们以其活性成分松脂醇二葡萄糖苷(PDG)、京尼平和京尼平苷含量作为技术参数，制订健骨痛消丸的质量标准。应用高效液相色谱法测定杜仲中主要活性成分的方法已有文献报道[5-8]，我们采用高效液相色谱-示差折光检测法(HPLC-RID)对健骨痛消丸中PDG、京尼平和京尼平苷含量进行定量检测。通过对比该方法与高效液相色谱紫外检测器的检测结果，检验该方法的可靠性与准确性。并且了解健骨痛消丸提取液及活性成分的抗凝血作用。

1 仪器及试剂

Waters HPLC ( Milford， Massachusetts，USA):泵Waters1515 ， 自动进样器 Waters 2707，检测器Waters UV/Visible Detector 2489， Waters Refractive Detector 2414， Elite C18色谱柱 (250×4.6 mm i.d.， 5 μm);酶标仪(Thermo Fisher Scientific Oy， Finland)。

凝血活酶时间(APTT)测定试剂盒、凝血酶原时间(PT)测定试剂盒、凝血酶时间(TT)测定试剂盒，武汉中太生物科技有限公司。松脂醇二葡萄糖苷，京尼平和京尼平苷对照品，购自上海源叶生物技术有限公司(CAS 型号:63902-38-5，HPLC≥98%)。健骨痛消丸样品为自制水丸样品。甲醇为色谱纯; 水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

实验动物:SD 大鼠，体质量180 ～ 220 g，均为清洁级;来源:河南省实验动物中心;许可证号:SCXK-2017-0001。

2 PDG、京尼平和京尼平苷含量的测定

2.1 紫外扫描

将标准品配成合适的浓度，从210 nm 到360 nm 波长进行扫描，测出其紫外最大吸收波长。

2.2 色谱条件

流动相，水、甲醇体积比 = 30∶70。 进样量=20.0 μL， 温度=30 ℃， 流速=0.8 mL/min。样品分别经过紫外检测器和示差折光率检测器。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取PDG、京尼平和京尼平苷对照品10.8、10.5和10.2 mg，加甲醇定容至10.0 mL，制成1 mL 含PDG、京尼平和京尼平苷分别为1.08、1.05和1.02 mg的母液，通过稀释即得各种浓度的溶液。

2.4 检测限和定量限

2.4.1 检测限

以对照品峰信噪比( S/N) 为 5 时计算，确定PDG、京尼平和京尼平苷检测限分别为0.021 6、0.063 2 、0.018 6 mg/mL。

2.4.2 定量限

按对照品峰信噪比( S /N) 为 10 时计算，确定PDG、京尼平和京尼平苷的检测限为0.047 5、0.014 6、0.040 9 mg/mL。

2.5 标准曲线的绘制

将PDG、京尼平和京尼平苷母液分别稀释成为不同浓度的溶液，按上述确定的色谱条件进行测定，以峰面积积分值(Y) 为纵坐标，对照品的浓度 (X)为横坐标，绘制标准曲线，得到PDG 的线性回归方程Y= 0.142X-0.0004 (R2= 0.9999)，京尼平的线性回归方程Y=0.003X+ 0.001 (R2=0.9970)，京尼平苷的线性回归方程Y= 0.011X+ 0.002(R2= 0. 9940)。

2.6 精密度实验

准确吸取同一对照品溶液，同一天连续测定 5次，测定PDG、京尼平和京尼平苷的峰面积，计算RSD 分别为 0.58%、0.46%和0.62%。上述对照品分别测定3 d，每天测定 5 次，测定PDG、京尼平和京尼平苷的峰面积，计算 RSD 分别为 1.02%、1.23%、1.14% 。

2.7 供试品溶液的制备

药品水丸适量，研细，称取10.0 g， 用氯仿回流提取6 h，抽滤后固体物再用甲醇(固液比1∶10)60 ℃加热搅拌回流提取 2 h，抽滤，药渣再按照同样方法继续提取，如是4次，滤液定容。以不用氯仿回流提取作为对照，同样连续提取4次发现:第2次提取的京尼平，第3次提取的京尼平苷，第4次提取出PDG 含量可以忽略不计。所以连续提取样品3次可以将水丸中的PDG、京尼平和京尼平苷基本提取完全。

2.8 重复性实验

取同一批号样品(批号150723) 3份，按 2.6 项下操作，在上述色谱条件下进行测定，计算PDG、京尼平和京尼平苷色谱峰的峰面积，RSD 分别为2.41%、3.24%、3.46%

2.9 加样回收率实验

取已知PDG、京尼平和京尼平苷含量的健骨痛消丸( 水丸) 粉末(批号150723) 约 1.0 g，精密称定 9 份，每 3 份加入相同体积的标准液(分别为0.10、0.20、0.30 mL) 的PDG、京尼平和京尼平苷对照品，按供试品溶液制备项下方法操作，测定。计算PDG、京尼平和京尼平苷回收率及 RSD 分别为102.4%、3.9%; 99.2%、2.8%;101.6%、3.2%。

2.10 健骨痛消丸中PDG、京尼平和京尼平苷的含量

称取质量相近健骨痛消丸样品，按照上述提取方法，同时采用高效液相色谱紫外检测器与示差折光率检测器测定成药中PDG、京尼平和京尼平苷的含量。

2.11 健骨痛消丸提取液及其活性成分抗凝血实验

以活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT) 3个体外抗凝血指标作为检测指标，对溶液提取物抗凝血效果进行研究。

2.11.1 动物血浆的制备

选择SPF级大鼠，眼眶取血，称取380 mg的柠檬酸钠用10 mL生理盐水溶解配置成浓度为0.109 mol/L的柠檬酸钠抗凝剂，血液与抗凝剂的体积比为9∶1，3 000 r/min离心15 min，取上层血浆备用。以等量的生理盐水(9 g/L)作为阴性对照组。

2.11.2 活化部分凝血活酶时间(APTT)的测定

取血浆100 μL，药液100 μL 和100 μL APTT试剂加入凝血槽中加钢珠混匀，各设置3个复孔，37℃孵育3 min后加入预温10 min的CaCl2100 μL，用凝血分析仪测定其凝固时间。

2.11.3 凝血酶原时间(PT)的测定

取血浆100 μL，药液100 μL 加入凝血槽中加钢珠混匀，各设置3个复孔，37 ℃孵育3 min后加入预温10 min的PT 试剂100 μL，用凝血分析仪测定其凝固时间。

2.11.4 凝血酶时间(TT)的测定

取血浆100 μL，药液100 μL 加入凝血槽中加钢珠混匀，各设置3个复孔，37 ℃孵育3 min后加入预温10 min的TT 试剂100 μL，用凝血分析仪测定其凝固时间。

2.12 统计分析

平行3次实验求均值和方差。T-test采用双尾检验，以P＜ 0.05作为显著性水平标准检测。

3 结果与讨论

目前，高效液相色谱测定药品中有效成分含量的方法通常采用的都是在不同波长下的紫外检测[2-8]。研究所涉及杜仲有效成分的最大紫外吸收波长都不相同，PDG 有2个吸收峰，分别在227 nm和277 nm 附近，京尼平的最大吸收波长在240 nm，京尼平苷的最大吸收波长在238 nm(图1)，这就会引起检测的不便。示差折光率检测器的检测范围具有广泛性，可用于检测糖类、聚合物等物质[9-10]。PDG、京尼平和京尼平苷含有共轭结构，因此这些物质既可用紫外检测，又可用示差折光率检测器进行检测。

图1 PDG、京尼平和京尼平苷标准品紫外扫描图谱

由于样品先经过紫外检测器，后经过示差折光率检测器，所以其的出峰时间比紫外吸收的出峰时间晚(图2)。同时也可看出，相同质量浓度的京尼平的紫外吸收峰面积比京尼平苷的峰面积大，而示差折光率检测的峰面积却比京尼平苷的小，这说明示差折光率检测器对含有糖基的物质的更灵敏，从检测限及回归方程的自变量的系数(表1)也可以得出类似的结论。

采用HPLC-RID 可同时测定不同有效物质的含量，避免了不同有效物质最大吸收波长不同对实验造成的不利影响。通过精密度实验，重复性实验和加样回收率实验，表明HPLC-RID 的测定结果是可靠的。采用HPLC-RID 法测定成药中PDG、京尼平和京尼平苷的含量分别为(3.52±0.085)mg/g、(32.6±1.6)μg/g、(221±9.5) μg/g，与HPLC-UV检测方法相比，结果无显著性差异(表1)。 对健骨痛消丸提取有效成分前，采用氯仿处理可以有效提高PDG、京尼平和京尼平苷的提取效率(图3)，推测是由于氯仿可以除去杜仲胶从而使得有效成分可以更有效的释放出来。

体外抗凝血活性实验中， APTT、PT 和TT 是医学上常用来确定凝血途径的三项指标，灯盏花素为中药提取制剂，主要有抗凝血、抗血栓形成，改善血液流变性及微循环，增加脑血流量，抗心肌缺血，提高机体耐缺氧能力等作用[11-12]。

图2 PDG、京尼平和京尼平苷标准品高效液相图谱(a： HPLC-UV;b：HPLC-RIS)

表1 HPLC-RID 与HPLC-UV 检测样品中PDG、京尼平和京尼平苷含量的比较

实验的抗凝血实验表明，健骨痛消丸提取液的PT、APTT、TT 实验的值显著大于阴性对照组和灯盏花素;几种检测出的活性成分中，京尼平的PT 活性最强;几种活性成分APTT 活性均强于对照(表2)，提取液的抗凝血作用比单一活性成分强推测是由于几种成分联合作用的结果，也可能是由于丸剂中的其他成分在起作用;几种活性成分的TT 实验值显著小于对照，而提取液实验值大于对照，可能是由于丸剂中的其他成分在起作用。 血栓的形成涉及到机体的凝血功能、血小板凝聚功能等多种因素，目前抗血栓药物的研究主要集中在对血液流变学、凝血系统、抗凝系统、纤溶系统及对血小板的影响等方面[13]。健骨痛消丸提取液可明显延长凝血时间，和PT、APTT 和TT 值，从而发挥抗凝血作用，其活性优于灯盏花素，而灯盏花素具有抗凝血、抗血栓形成的作用，健骨痛消丸可能也具有相似的作用。

表2 健骨痛消丸中活性成分及提取液的抗凝血作用

图3 健骨痛消丸中PDG、京尼平和京尼平苷提取效果的比较

4 结论

HPLC-RIS 可以同时测定最大吸收波长不同的几种有效物质，而且方法简单，结果可靠。从京尼平和京尼平苷这两种物质的检测中可知，示差折光率检测器对含有糖基类物质更为敏感，检测限更低。所以，HPLC-RIS更适合用来检测含有糖基类的物质。健骨痛消丸中，PDG 含量最高，京尼平苷次之，京尼平含量最少。对健骨痛消丸提取前采用氯仿处理，可以使活性成分提取更为有效。健骨痛消丸提取液的PT、APTT、TT实验显著优于对照，京尼平的PT 活性最强，几种活性成分APTT活性均优于对照，提取液的抗凝血作用比单一活性成分强可能是优于浓度较高可能是由于几种成分联合作用的结果。