陈 娟，丁兰平，李 奥，李园园，刘丽丽

（1.天津师范大学生命科学学院，天津300387；2.天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室，天津300387）

小球藻是一类真核单细胞藻类，属于小球藻目（Chlorellales）小球藻科（Chlorellaceae）. 国内外广泛培养的椭圆小球藻（Chlorella ellipsoidea）和蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）现分别被命名为椭圆球藻（Chloroidium ellipsoideum） 和 蛋 白 核 异 养 球 藻（Auxenochlorella pyrenoidosa），与小球藻属（Chlorella）一起统称为小球藻类（Chlorella complex）[1]. 小球藻类富含蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素、矿物质和碳水化合物，也是已知含量最高的叶绿素来源，其叶绿素质量分数超过2%[2-3].由于营养价值高且有利于健康，小球藻类已成为人们重要的营养补充剂，也可以加工成动物饲料和其他高价值产品[3-4]. 小球藻的脂质含量高，超过大多数陆生植物，是生物燃料生产的最佳候选微藻物种，也是最具潜力、最能实现可持续供给油脂的生物质资源之一[5-8].另外，作为理想的研究基因表达及生理生化性质的藻种，小球藻类也已广泛应用于基因工程领域[9]. 利用生物反应器培养转基因小球藻类具有比较明显的优势，其分离纯化表达产物和操作方法步骤简单，产业化培养技术成熟，适宜于规模化生产[10-11].

我国抗生素的产量和使用量逐年增加，且存在过度使用的情况.抗生素的滥用，对陆地和水体环境均构成了潜在污染[12-13].博来霉素是一种水溶性抗生素，应用广泛.有研究发现，博来霉素能抑制微拟球藻的生长[14-15].Gus 基因是目前应用较多的一种报告基因，可编码β-葡萄糖苷酸酶，用于检测外源基因的转化效率，方法简单且灵敏度高[16].基于人工导入外源目的基因的小球藻类可能在环境适应、生长和油脂转化等方面发生变化的设想，本课题组前期利用基因转染技术将Gus 基因成功转入野生型椭圆球藻[17]，期望筛选到适应环境能力强、生长快且产油率高的转基因培养品系.在此基础上，本研究拟通过对比分析不同浓度的博来霉素对转基因椭圆球藻pUGus 和野生型椭圆球藻的细胞密度、藻粉和油脂产量的影响，进一步了解外源基因片段对小球藻类敏感性、生长速率和代谢物生成的影响，为筛选环境适应能力强、产油率高的优质转基因椭圆球藻新品系以及构建生物能源生产模式提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 藻种

野生型椭圆球藻Chloroidium ellipsoideum（SD-0701），购于中国科学院淡水藻种库；pUGus 型椭圆球藻（SD-0702，将Gus 基因转入野生型椭圆球藻），由天津师范大学微生物实验室保存.

1.1.2 试剂

葡萄糖、酵母粉、Ca（NO3）2、KH2PO4、MgSO4·7H2O、KCl、FeCl3·6H2O，分析纯级（AR），购自天津市科密欧化学试剂有限公司；博来霉素，分析纯级（AR），购自天津智蓝欣佰生物技术有限责任公司.

Knap 培养基（/L）：葡萄糖3 g、酵母粉3 g、Ca（NO3）20.1 g、KH2PO40.025 g、MgSO4·7H2O 0.025 g、KCl 0.012 g、FeCl3·6H2O 0.2 g.共设置9个处理组，博来霉素质量浓度梯度为：0（对照组Ⅰ和对照组Ⅱ）、4、6、8、10、12、14 和16 μg/mL，每组各3个重复，共27个处理.

1.2 方法

取对照组Ⅰ处于对数生长期的2 种椭圆球藻细胞各3.676×107个，分别转接至对照组Ⅱ和7个博来霉素含量不同的处理组中，培养基体积为30 mL，保证每瓶接种量一致，光照强度50 μmol/（m2·s）、25 ℃条件下静置培养8 d，每组各3个重复，共24个处理.

1.2.1 标准曲线绘制

藻液细胞密度与吸光度标准曲线绘制：取对照组Ⅰ中处于指数期或者稳定期的密度较大且无污染的藻种原液，分别稀释2、4、6、10、20、40、60 和100 倍，利用分光光度法和血球计数法测定不同稀释倍数藻液的OD680值和细胞密度，以细胞密度为横坐标，OD680值为纵坐标，得到藻液吸光度与细胞密度的标准曲线：y0=25.879x-1.776，R2=0.9756，其中x为细胞密度（106mL-1），y0为藻液的OD680值.

油脂含量与吸光度标准曲线绘制：分别称取对照组Ⅰ的干制藻粉0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg，以香草醛比色法浸提待测样品的总脂[18]，在528 nm 下进行比色.绘制标准曲线：y1=5.8246x+0.0957，R2=0.9970，其中x为油脂质量，y1为OD528值.

1.2.2 干藻粉的制备

椭圆球藻培养至第8 天，取各处理组的藻液10 mL，3500 r/min 下离心4 min，去除上清，收获沉淀.将沉淀在-80 ℃冰箱中反复冻融2 次，每次间隔12 h，于25 ℃下风干约48 h 至恒重.

1.2.3 细胞密度、藻粉产量及油脂含量的测量

每天定时取样，利用紫外分光光度计测量各个处理组藻液的OD680值，根据标准曲线y0计算藻液细胞密度.称量1.2.2 制备的藻粉干重并计算产量.取各处理组干藻粉2 mg，以香草醛比色法制备待测样品的总脂，测定样品的OD528值，根据标准曲线y1计算椭圆球藻的产油率及油脂产量.

1.3 数据处理

用Excel 进行数据处理，用Spss17.0 软件进行单因素方差（One-Way ANOVA）统计分析.

2 结果与分析

2.1 博来霉素对椭圆球藻生长的影响

培养基中添加不同质量的博来霉素，培养期内SD-0701 和SD-0702 的生长情况如图1 所示.

图1 博来霉素对SD-0701 和SD-0702 细胞密度的影响Fig.1 Effect of zeocin on the cell density of SD-0701 and SD-0702

由图1 可以看出，随着培养时间的延长，SD-0701和SD-0702 的生长均呈上升趋势.博来霉素对2个藻株的生长均存在一定的抑制作用，且质量浓度越大抑制作用越明显.比较2个藻株的生长情况可知，博来霉素对野生型椭圆球藻（SD-0701）的抑制作用显著强于pUGus 型椭圆球藻（SD-0702）.

博来霉素虽然对SD-0701 生长的抑制作用明显，但受浓度影响较小，在培养的第8 天，对照组中SD-0701 的细胞密度达7.494×108mL-1，各博来霉素浓度处理组中的细胞密度相近，约为0.756×108mL-1.博来霉素对SD-0702 生长的抑制作用明显受浓度的影响，浓度越高抑制越强烈.不添加博来霉素的2个对照组中，SD-0701 和SD-0702 的生长状况存在差异，在培养的第8 天，SD-0702 的细胞密度为6.377×108mL-1，低于SD-0701 的细胞密度.SD-0701 在培养基中添加博来霉素后基本处于停止生长的状态，博来霉素质量浓度为4 μg/mL 时抑制率已经达到87.31%；而SD-0702仅在添加14 μg/mL 和16 μg/mL 的博来霉素后基本处于停止生长的状态，抑制率分别为88.68%和88.63%，添加4 μg/mL 时抑制率仅为12.23%.由此可见，SD-0701对博来霉素的抗性差，而SD-0702 对博来霉素的抗性较强，且与博来霉素的浓度相关，低浓度的博来霉素对SD-0702 生长的影响较小，高浓度的抑制作用明显.

2.2 博来霉素对椭圆球藻藻粉产量的影响

静置培养的第8 天，各处理组中椭圆球藻藻粉的产量如图2 所示.

图2 博来霉素对SD-0701 和SD-0702 藻粉产量的影响Fig.2 Effect of zeocin on the yield of algal powder of SD-0701 and SD-0702

由图2 可以看出，博来霉素对SD-0701 和SD-0702的藻粉产量均存在一定的抑制作用.培养基中未添加博来霉素时，SD-0701 的藻粉产量略高于SD-0702，分别为3.34 g/L 和3.21 g/L. 添加博来霉素后，因SD-0701 对博来霉素敏感，细胞生长受到严重抑制，因此制备不出藻粉.博来霉素对SD-0702 藻粉产量的抑制作用明显受添加量的影响，浓度越高抑制越明显.博来霉素质量浓度为4 μg/mL 和6 μg/mL 时，SD-0702 的藻粉产量分别降低12.44%和13.81%，随着博来霉素质量浓度的增加，藻粉产量大幅度下降，质量浓度为14 μg/mL 和16 μg/mL 时，藻粉产量分别下降58.64%和66.31%.

2.3 博来霉素对椭圆球藻含油率和油脂产量的影响

培养基中添加不同质量的博来霉素时，各处理组中SD-0701 和SD-0702 的含油率和油脂产量如图3所示.

图3 博来霉素对SD-0701 和SD-0702 含油率和油脂产量的影响Fig.3 Effect of zeocin on oil content and yield of SD-0701 and SD-0702

由图3（a）可以看出，不添加博来霉素时，SD-0701的含油率略高于SD-0702，分别为14.20%和13.61%.培养基中添加博来霉素时，SD-0702 的含油率明显受博来霉素浓度的影响，低浓度会稍微促进其油脂积累，高浓度则产生抑制作用.博来霉素质量浓度为4、6和8 μg/mL 时，SD-0702 的含油率分别为14.38%、14.27%、13.66%，超过对照组的含油率；质量浓度为10、12、14和16 μg/mL 时，SD-0702 的含油率分别为13.10%、12.70%、10.26%和9.89%，低于对照组的含油率.

由图3（b）可以看出，不添加博来霉素时，SD-0701和SD-0702 油脂产量分别为0.474 g/L 和0.436 g/L.博来霉素质量浓度较低时（≤6 μg/mL），SD-0702 的油脂产量略有下降，博来霉素质量浓度超过6 μg/mL 时，油脂产量急剧下降.

3 讨论

本研究以野生型椭圆球藻（SD-0701）和含有外源基因Gus 的椭圆球藻（SD-0702）为实验材料，在Knap培养基中添加不同质量的博来霉素，观察测量2个藻株的生长、藻粉产量、含油率和油脂产量.培养基中不添加博来霉素时，野生型椭圆球藻的细胞密度、藻粉产量、含油率和油脂产量均高于含有外源基因Gus 的椭圆球藻.吴海月等[19]研究发现，含有外源基因Gus 的藻株性能较野生型藻株低，生长速率低，代时长，藻粉产量低，油脂产量也低，与本研究结果相符.当添加博来霉素时，转入外源基因Gus 的藻株生长速率明显高于野生型藻株.博来霉素质量浓度为4 μg/mL 时，野生型藻株的生长就受到显著抑制；随着培养基中博来霉素浓度的增加，转入外源基因Gus 的藻株所受的抑制作用也随之增强，但在添加14 μg/mL 和16 μg/mL 的博来霉素时才受到较强的抑制作用.张琳等[15]研究表明，微拟球藻对博来霉素高度敏感，在固体培养时，0.5 μg/mL博来霉素即可完全抑制微拟球藻生长，在液体培养时，1 μg/mL 博来霉素即可完全抑制其生长.本研究结果表明，在Knap 液体培养基中添加4 μg/mL 博来霉素时野生型椭圆球藻基本停止生长，与微拟球藻的完全抑制浓度不同，这可能是由于不同藻种对博来霉素的敏感程度不同.

培养基中添加4 μg/mL 的博来霉素时，2 种椭圆球藻的生长均开始受到抑制，此时博来霉素对SD-0701的抑制率达到87.31%，对SD-0702 的抑制率仅有12.23%.由于SD-0701 在博来霉素质量浓度为4 μg/mL时已经基本停止生长，藻粉产量微小无法制备，油脂产量极低；但SD-0702 在此质量浓度下藻粉产量和油脂产量的抑制率仅分别为12.44%和8.49%，当质量浓度为16 μg/mL 时藻粉产量和油脂产量的抑制率分别达到66.31%和75.46%. 由此可见，SD-0701 对博来霉素的抗性差，而SD-0702 具有较强抗性，且与博来霉素浓度相关，高浓度的博来霉素对SD-0702 有显著抑制作用.

综合以上结果，野生型椭圆球藻内转入外源基因Gus 确实能够影响其对抗生素的敏感性、生长速率和代谢物的生成.野生型椭圆球藻对博来霉素很敏感，抗性差；转入外源基因Gus 的椭圆球藻对博来霉素敏感程度弱，抗性较强.相对于野生型椭圆球藻，转入外源基因Gus 的藻株在低抗生素污染的水体中具有适应能力强、生长情况好以及产油率高的特性，适合在低污染水体中推广应用.另外，本研究也表明博来霉素可作为筛选培养基，用于识别小球藻类的抗性基因.