史文娴，刘晓菲，李斐斐，王晓娜，孙 颖

1.山东中医药大学(济南 250335)；2.山东中医药大学附属医院(山东省中医经典名方协同创新中心)(济南250335)；3.山东中医药大学第一临床医学院(济南 250335)

乳腺癌是发生于乳房的恶性肿瘤，目前临床上已经成为女性最常见的恶性肿瘤之一，对女性的生活质量和生命健康带来严重的威胁。目前大多数学者认为乳腺癌癌前病变是其癌变过程之必经环节，是可以逆转和阻断的，所以发挥中医药的优势，对患者的个体化治疗,逆转或阻断这一环节,对乳腺癌二级预防、降低乳腺癌发病率具有重要意义[1-2]。乳腺恶性肿瘤中最能有效提高生存率、降低死亡率的重要方法是二级预防，临床上早期乳腺癌的发现率仅25%[3]，中医逐渐成为乳腺癌治疗的方法，整体观念和辨证论治思想指导用药，具有很大的发展潜力[4]。目前研究发现，以Bcl-2蛋白家族的表达和调控对肿瘤细胞凋亡具有较大的影响[5]，细胞色素C蛋白的表达在细胞凋亡和炎症中发挥着积极作用[6]。基于此，本实验采用中药阳和化岩汤与三苯氧胺相比，研究其对乳腺癌癌前病变细胞凋亡关键因子Bcl-2、细胞色素C蛋白及基因表达的影响。

材料与方法

1 材 料

1.1 细胞系来源：乳腺癌癌前病变细胞为MCF-10AT细胞，由陈红风主任(上海龙华医院)惠赠。

1.2 药物与试剂：DMEM/F-12培养基，RNA提取试剂盒(Trizol)、胰蛋白酶粉(Trypsin)、DMSO、MTT、Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒、RNA酶、驴抗兔IgG，化学发光剂、即用型SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、ECL发光剂、蛋白酶抑制剂、蛋白上样缓冲液、胎牛血清(FBS)、碘化丙啶(Propidium iodide，PI)、Western及IP细胞裂解液，细胞色素C、Bcl-2一抗，BCA蛋白浓度测定试剂盒(南京凯基生物科技公司)，逆转录试剂盒(Fermentas公司)，RT-PCR试剂盒(Invitrogen公司)，RT-PCR所有引物(Invitrogen公司)，及其余常规生化试剂。

1.3 仪器：BB16uv/BB5060uv CO2培养箱、Axiovert 40倒置相差显微镜、Elx50型洗板机、ELx808全自动酶标仪、Sgavplus型超纯水系统、水平电泳槽、ClassⅡ2085型超净工作台、LAS-4000型化学发光及荧光影像分析仪、DT5-3型低速自动平衡离心机、ME235P电子分析天平、梅特勒-托利多DELTA320型pH计、Veriti 96孔型梯度PCR仪、FACSCalibur 流式细胞仪，HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统、冷冻超速离心机、CA-1390-1超净工作台(上净公司)、CM1900型冰冻切片机(LEICA公司)、一次性平皿、凝胶成像仪、石蜡包埋机、天能凝胶成像分析系统、显影机、稳压稳流电泳仪等。

2 实验方法

2.1 中药制备：阳和化岩汤组由鹿角霜、山慈菇、莪术、白花蛇舌草各12 g，淫羊藿、三棱、浙贝、半夏各9 g组成。制剂：将10倍量的水加入上述中药方，6 h内提取收集其挥发油，保存、备用；提取挥发油后的药液滤过，浓缩至1∶1.5(药材：中药药液)，加入适量乙醇，使乙醇含量达到60%，静置24 h后，将上清液分离，离心中药液沉淀，减压、回收，乙醇浓缩，将相对密度浓缩至1.18(60℃)，备用。将挥发油加入上述药物提取液中混匀，倒入提取液中，搅拌均匀，另倒入梨酸、山蔗糖调节pH值，并加水将其浓度调整到0.84 g/ml。采用上述方法制备各拆方组，温阳组(鹿角霜、淫羊藿各12 g)0.21 g/ml、活血组(三棱9 g、莪术12 g)0.21 g/ml、化痰组(半夏、浙贝各9 g)0.18 g/ml、解毒组(白花蛇舌草、山慈菇各12 g)0.27 g/ml。三苯氧胺(TAM)制备：溶于生理盐水，浓度为0.03 mg/ml。对照组不加任何处理因素。

2.2 肠吸收液制备：禁食12 h的大鼠断颈椎处死，迅速剖开腹腔取出小肠，自回盲瓣向上5 cm处向上取14 cm小肠段，将肠内容物完全取出，在TYRODE液中冲洗肠管，并翻转肠管，结扎成囊状，将前处理中药液预先加入麦氏浴管中，通入95%的O2和5%的CO2,37 ℃恒温，同时开始计时，分别在15、30、45、60、90、120 min取样200 μl，同时补充等体积TYRODE,-20℃保存待用。用氮气吹干前处理所得阳和化岩汤肠吸收液，将1 ml的80%的甲醇加入中药液复浴，超声3 min，涡旋30 s。0.2 μg滤膜过滤。把肠吸收液混匀后，用无菌滤膜滤过除菌，所得样品分装于无菌EP管，-20℃保存待用。

2.3 Western blot法检测Bcl-2、细胞色素C蛋白表达：检测阳和化岩汤组、温阳组、活血组、化痰组、解毒组、三苯氧胺组及空白对照组处理乳腺癌癌前病变MCF-10AT细胞株72 h，收集细胞，用冷PBS反复洗涤2次，加入 200 μl 预冷裂解缓冲液，混匀、冰浴，时间为30 min，30 min后进行离心，取上清液，加水稀释，至浓度为50 μg /ml，取等量70 μg /泳道的蛋白，电泳条件：浓缩胶恒压60 V，时间20 min，分离胶恒压80 V ，时间80 min。电转移至PVDF 膜，取脱脂奶粉(浓度为5%)将其封闭，时间1 h，剂量0.1 ml/cm2，另加入适量一抗及封闭液， Bcl-2：细胞色素C的稀释比例为1∶400。摇荡孵育，温度4℃下过夜。用PBST漂洗过的PVDF膜和与HRP 结合稀释比例1∶5000的二抗，摇荡孵育，温度：室温，时间： 1～2 h， PBST 充分洗膜。显影液(0.1 ml/cm2)计算用量， PVDF 膜上加显影液，显影并洗像。调整时间使其曝光，直至出现最佳条带。

2.4 RT- PCR法检测Bcl-2、细胞色素CmRNA表达：将细胞分别用液氮研磨粉碎后放入离心管中,Trizol法提取总RNA,每只总RNA 量为2 μ,内参照为扩增GAPDH,每个标本至少重复3遍。引物序列:COX-2长度为253 bp,上游:5’-AGCAGCCATTCATCAACACT-3’,下游:5’-GGCAGCTGGAACTCAATGTA-3,内参长度为286 bp,上游:5’-GCCAGATCATCATCAGCAAT-3’,下游:5’-AGGACGTCCACTGACACCTT-3’，VEGFC长度为164bbp,上游:5’-CGGGCTGTGGATCCTGGATGACCGCC-3’，下游:5’-GGAATTCAGCTCCATTGACTTCTTGG-3’;VEGFR-3长度为189 bp,上游:5’-ACCGGAGCTAAACAAGGATG-3’,下游:5’-TGGTGGTGGAACTTCTTTCC-3’;恒温70 ℃，加热时间为5 min，2 min迅速冷却，42 ℃温浴60 min，然后升高温度至95 ℃，加热时间为5 min，以终止反应逆转录合成cDNA，94 ℃条件下加热3 min进行预变性，然后开始循环操作：温度94 ℃，时间45 s，温度52 ℃，时间60 s，温度72 ℃，时间60 s，共循环操作30次,最后温度72 ℃延伸，时长7 min。取10 μl扩增产物在2.0%琼脂糖凝胶上进行电泳分离，电泳分离终止后，用Band Scan 4.3版图像分析软件分析，取电泳条带的光密度值与内参照GAPDH光密度值的比值，作为目标基因的相对光表达量。

结 果

1 Bcl-2、细胞色素C蛋白表达比率 与空白组比较，各组Bcl-2蛋白表达比率均下降，阳和化岩汤组、活血组、化痰组、三苯氧胺组比率下降(P<0.05)；与三苯氧胺组比较，阳和化岩汤组(P>0.05)。见表1。

表1 Western blot法检测Bcl-2蛋白表达比率

与空白组相比，各组细胞色素C蛋白表达比率均下降，阳和化岩汤组、三苯氧胺组(P<0.05)；阳和化岩汤组、三苯氧胺组组间比较(P>0.05)。见表2。

表2 Western blot法检测细胞色素C蛋白表达比率

空白对照组Bcl-2 mRNA表达量最高，与空白对照组相比，各组Bcl-2 mRNA表达量呈明显下降趋势。空白对照组细胞色素C mRNA表达量最低，与空白对照组相比，各组细胞色素C mRNA表达量呈明显上升趋势(图1)。

注：1阳和化岩汤组；2温阳组；3活血组；4化痰组；5解毒组；6三苯氧胺组；7空白对照组

2 Bcl-2 mRNA表达 见表3(图2)。空白对照组Bcl-2 mRNA表达量最高，三苯氧胺组、阳和化岩汤组、解毒组Bcl-2 mRNA表达量呈明显下降趋势，尤其阳和化岩汤组Bcl-2 mRNA表达量下降明显，与三苯氧胺组比较，具有统计学差异(P<0.05)。空白对照组Bcl-2 mRNA表达量最高，三苯氧胺组、阳和化岩汤组、解毒组Bcl-2mRNA表达量呈明显下降趋势。

表3 RT-PCR检测Bcl-2 mRNA表达量

注：1阳和化岩汤组；2温阳组；3活血组；4化痰组；5解毒组；6三苯氧胺组；7空白对照组

图2 RT-PCR检测Bcl-2 mRNA表达

3 RT-PCR检测细胞色素C mRNA表达 阳和化岩汤组、三苯氧胺组细胞色素C mRNA表达比率高于空白对照组，与三苯氧胺组比较阳和化岩汤组无统计学差异，均可抑制细胞增殖。其余4个中药拆方组细胞色素C mRNA表达比率有增高趋势，但无统计学差异。提示三苯氧胺组、阳和化岩汤组均促进细胞色素C蛋白表达增高， mRNA表达比率增高，基因有扩增，提示三苯氧胺组、阳和化岩汤组在细胞凋亡早期可有效促进凋亡诱导因子细胞色素C，通过线粒体途径诱导细胞凋亡。见表4。空白对照组细胞色素C mRNA表达量最低，三苯氧胺组、阳和化岩汤组细胞色素CmRNA表达量均有升高趋势(图3)。

表4 RT-PCR检测细胞色素C mRNA表达量

注：与空白对照组相比，△P<0.05

注：1阳和化岩汤组；2温阳组；3活血组；4化痰组；5解毒组；6三苯氧胺组；7空白对照组

图3 RT-PCR检测细胞色素C mRNA表达量

讨 论

本病中医学中称为“乳岩”，乳岩主要病机为六淫内侵，肝脾气郁，冲任不和，脏腑功能失调，以致气滞、血瘀、痰凝、邪毒结于乳腺，则表现为乳腺癌。本实验采用阳和化岩汤进行研究，阳和化岩汤出自《外科医镜》，方中所含多种中药具有抗肿瘤作用，鹿角霜温补肾阳肾精、收敛止血，实验研究示，鹿角霜能通过刺激血液中T淋巴细胞的增殖抑制小鼠乳腺癌细胞生长[7]，鹿角霜还有活血化瘀之效，有利于改善乳腺癌血液高凝状态，肉桂补火助阳散寒、益脾除积，肉桂中含有的肉桂醛能参与细胞内信号通路，调节肿瘤细胞的增殖及凋亡[8]，淫羊藿、鹿角霜温补少阴，两者均富含雄激素，既可以补充雄激素又能拮抗雌激素，淫羊藿主要通过降低肿瘤细胞端粒酶活性、抑制肿瘤细胞增殖分化、改变肿瘤细胞周期分布等[9]，浙贝母化痰散结，排痈消肿，浙贝片联合化疗提高肿瘤抑制率的机制可能是调节细胞凋亡途径，增加耐药性强的肿瘤细胞对化疗药的敏感性，从而起到逆转肿瘤细胞耐药性的作用[10]，莪术破瘀止痛、行气解郁，莪术油具有明显的抗肿瘤作用，许政旭等[11]研究发现，莪术油可通过下调死亡因子及其受体通路，导致相关癌基因的表达下调，增强免疫作用，使癌细胞凋亡，莪术、三棱均有破血行气,消积止痛的作用，李学臣等[12]研究发现三棱水的提取物能够抑制小鼠肿瘤细胞生长，山慈菇清热解毒，化痰散结，山慈菇提取物对小鼠乳腺癌细胞增殖具有明显的抑制作用和促凋亡作用[13]，白花蛇舌草清热解毒，其中的萜类化合物可通过调节凋亡相关基因、抗氧化作用等抑制肿瘤细胞生长，促进肿瘤细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用[14]，甘草有调和诸药之效[15]。全方共奏活血祛瘀与温肾助阳之功，攻补兼施，温阳化痰法对延长乳腺癌患者的生存期有至关重要的疗效，温阳化痰法能起到减毒增效的作用，既能减缓乳腺癌细胞增殖，又能调节信号通路，抑制乳腺癌的癌变进程[16]，阳和化岩汤可抑制乳腺癌癌细胞的增殖，诱导乳腺癌癌细胞的凋亡[17]。

他莫昔芬是绝经前激素受体阳性乳腺癌辅助内分泌治疗的标准药物，是合成的抗雌激素药物，具有抗雌激素、弱雌激素的双重作用，竞争性的结合靶细胞ER，降低细胞内ER含量，抑制肿瘤细胞的生长代谢，有效降低乳腺癌复发风险和病死率[18]，对雌激素受体阳性的患者效果好。此外，它还可以通过阻断因雌激素引起的乳腺管及管周纤维组织增生，帮助增生的乳腺组织恢复正常的水平[19]。

抑制细胞生长的主要途径是细胞凋亡，导致哺乳动物细胞凋亡的反应分两大类，包括内源性途径(线粒体途径)和外源性途径。Bcl-2是细胞凋亡研究中发挥关键作用的癌基因之一。Bcl-2主要分布在线粒体外膜表面，可以保护线粒体的完整性，进而阻止相关活化因子(如CytC)的释放，从而阻断凋亡信号，减轻细胞损伤。当Bcl-2表达较多时，与Bax形成大量异源二聚体，抑制Bax活性，使细胞凋亡减缓受阻，抑制大多数化疗药物所引起的靶细胞凋亡。细胞凋亡是一种由基因调控的细胞主动死亡过程，在机体生长发育、细胞分化和病理状态中起着重要的作用，在线粒体介导的内源性凋亡通路中，细胞色素C从线粒体释放到胞浆细胞是凋亡程序关键的一步，研究表明，线粒体转运孔孔径可以在凋亡刺激信号作用下增大，破坏线粒体的外膜，细胞色素C蛋白从线粒体内释放到胞质当中，形成凋亡复合体，使DNA修复酶活性受到抑制，细胞核的内切酶被激活，进而切割DNA，导致细胞凋亡。

综上所述，阳和化岩汤可明显降低Bcl-2蛋白及mRNA表达，激活细胞色素C，加速癌细胞的凋亡及阻断相关通路活化，进而抑制癌变进程。