滕天明，黄进勇，薛雨辰，黄龙飞，杨 清，孙跃民

(天津医科大学总医院 心血管内科，天津 300052)

近年来射血分数保留型心力衰竭(heart failure with preserved left ventricular ejection fraction, HFpEF)的患病率在逐渐增加，年死亡率约为22.2%，其发病机制仍不明确，目前尚无有效的治疗方案能够完全逆转HFpEF的自然病程[1]。目前有研究认为，左心室舒张功能障碍(LVDD)引发的心肌细胞内一系列病理生理改变可能是HFpEF细胞内源性发病机制之一。大量研究表明锌(Zinc，Zn)及锌转运体(Zinc transporter)与多种心血管疾病的发生发展密切相关，锌转运体包含ZnT和Zip两大家族，目前已经确定了10种ZnT和14种Zip锌转运体。本课题组前期研究中不仅发现锌转运体Zip2在心肌缺血再灌注小鼠心肌中表达明显上调，并通过调节STAT3发挥心肌保护作用[2]，而且还发现HEpEF大鼠心肌组织中Zip 14的mRNA和蛋白表达水平亦明显增高。目前尚无研究报道Zip13在LVDD心肌重构发生发展中的病理生理学作用，因此本文拟采用Dah1盐敏感大鼠制备LVDD模型，探讨锌转运体Zip13在LVDD大鼠心肌组织的表达变化及其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1动物 Dah1盐敏感性大鼠(Dah1 salt-sensitive rat，DSS)，雄性，5周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2012-0001。大鼠在环境温度20～25 ℃，相对湿度45%～55%，12 h/12 h光照周期，SPF屏障环境饲养盒内适应性饲养1周。

1.2主要试剂和仪器 Zip13兔多克隆抗体(BIORBYT, UK)，GAPDH抗体(Cell Signaling Technology，America)，HRP偶联山羊抗兔二抗(Sigma，America)。化学发光法检测试剂盒(Millipore，America)；总RNA提取试剂盒、cDNA逆转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒(Invitrogen，America)。所用引物均由美国Invitrogen公司合成。其余生化试剂均为国产分析纯。主要仪器包括CFX 96 Real-Time system(Bio-Rad，America)，电感耦合等离子光谱仪(ICP，PerKinElmer，America)，小动物超声仪(Vevo 2100 Imaging System，Canada)，尾套式智能无创血压仪(BP-2010 AUL Softron，Japan)等。

1.3主要方法

1.3.1动物模型的制备及标本采集 将36只DSS大鼠随机分为模型组(n=22)和对照组(n=14)。模型组和对照组饲料中氯化钠含量分别为8%和0.3%，其他组分含量完全相同(锌的含量均为30 mg/kg)。造模期内，每日记录体重、呼吸频度、毛色、反应和活动度等体征变化；每两周使用尾套式智能无创血压仪测量并记录心率和血压；分别于造模后第6周、12周和19周，采用小动物超声仪检测大鼠心功能相关指标：室间隔舒张末期厚度(IVSd)、左心室收缩末期内径(LVDs)、左心室舒张末期内径(LVDd)、舒张末左心室后壁厚度(LVPWd)、收缩末左心室后壁厚度(LVPWs)、左心室射血分数(LVEF)、左心室质量(LVM)、Weight和LVM/Weight。经各项指标证实模型制备成功后，收集各组大鼠血清，分离出左心室分装后储存于-80℃冰箱，用于提取蛋白、RNA及检测Zn离子浓度。

1.3.2实时定量荧光PCR(RT-qPCR)检测大鼠心肌组织Zip13 mRNA表达 Trizol法提取心肌组织总RNA。NanoDrop 2000 C 分光光度法测定总RNA浓度，经RNA甲醛变性电泳检测其完整性，然后行反转录为cDNA，再按照Real-Time PCR试剂盒说明书的标准操作步骤行PCR，GAPDH作为内参照，扩增条件为95 ℃ 1 min，(95 ℃ 15 s、Tx ℃ 30 s、72 ℃ 15 s)35个循环，72 ℃ 1 min。引物设计采用Primer 5.0软件设计，经Blast进行同源性比较，由Invitrogen公司合成(表1)，运用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达水平。

表1 实时定量RT-PCR引物序列

1.3.3Western Blot法检测大鼠心肌组织Zip13蛋白的表达 用RIPA提取各组大鼠心肌组织总蛋白，BCA法进行蛋白定量，取30 μg蛋白样品，加入2×上样缓冲液，煮沸5 min，进行SDS-PAGE电泳并电转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶溶液室温封闭90 min后，Zip 13抗体(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST 洗涤3次，每次10 min，孵兔抗大鼠二抗(1∶1 000)，室温孵育1 h，TBST洗涤4 次，每次15 min，ECL显影，GAPDH为内参，使用Image Lab软件对其进行数据分析处理。

1.3.4电感耦合等离子发射光谱法(ICP-OES)测定锌离子浓度 65%的浓硝酸进行心肌组织消解，配置标准品，标准曲线拟合度需达到0.9999以上，各组大鼠血清500 μl及1 ml超纯水加入到2 ml EP管中，使用电感耦合等离子光谱仪检测并记录数据。

1.3.5超声心动图检查 采用Vevo 2100 Imaging System小动物超声仪MS400探头(探头频率为30 MHz)行超声心动图检查，全部操作由培训的专业人员按照标准操作规程完成。分别在第6周、12周和19周，将两组大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉，胸前备皮、仰卧位固定，B-Mode获取左心室长轴切面，M型超声取样线置于乳头肌处，垂直于室间隔及左心室后壁，经M型超声曲线测量。获取指标主要包括： IVSd、IVSs、LVPWd、LVPWs、LVIDd和LVIDs。计算LVEF、LVM和LVM/Weight。

2 结 果

2.1两组大鼠基本情况 造模过程中，模型组共有5只大鼠死亡，对照组无死亡。与对照组比较，第19周时，经两名临床医师独立判定，模型组大鼠大部分表现为竖毛且毛色光泽度差，活动度下降，经常性闭目、反应不敏感，个别还出现呼吸频度明显加快等表现。

2.2两组大鼠血压、心率的变化 与对照组相比，模型组平均收缩压和舒张压差异有统计学意义(P<0.05)，而平均心率差异无统计学意义。不同时间点间的平均收缩压、舒张压和心率差异有统计学意义(P<0.05)；时间与处理因素的交互作用下平均收缩压差异有统计学意义(P<0.05)，而平均舒张压和心率差异无统计学意义。结果显示，模型组大鼠出现血压升高，尤其收缩压升高明显，见表2。

表2 两组大鼠血压和心率比较

注：1 mmHg=0.133 kPa

2.3两组大鼠超声心动指标的变化 第6周时，模型组大鼠的LVDd、LVDs、IVSd、LVPWd、LVPWs、LVEF、LVM、Weight及LVM/Weight差异无统计学意义；第12周时，模型组大鼠LVPWs、Weight及LVM/Weight明显增高(P<0.05)；第19周时，模型组大鼠LVDd、IVSd、LVPWd、LVPWs、LVM及LVM/Weight明显增高(P<0.05)，而Weight明显降低(P<0.05)，LVDs及LVEF差异仍无统计学意义(P>0.05)。模型组和对照组大鼠第19周的LVDd、LVDs、IVSd、LVPWd、LVPWs、LVM、和Weight值均高于第6周，而LVM/Weight和LVEF均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。时间与处理因素的交互作用差异有统计学意义(P<0.05)，结果表明第12周时，模型组大鼠已经出现明显不对称室壁增厚，尤其是LVPWd、LVPWs和LVM/Weight明显升高，进行性左心室舒张功能不全和心肌肥厚的征象已经开始显现。到第19周时，伴随模型组大鼠普遍意义的心肌尺径增厚，开始呈现收缩功能正常而舒张功能受损，左心室重构性肥厚明显，即出现明显的LVDD超声表现。见图1。

2.4两组大鼠血清和心肌组织中锌离子浓度浓度的变化 ICP-OES检测结果表明，与对照组相比，模型组大鼠心肌组织中的锌含量显著增加，而血清中锌离子浓度则明显降低，见图2。

2.5两组大鼠心肌组织中Zip13 mRNA和蛋白的表达变化 与对照组相比，模型组心肌组织Zip13 mRNA的表达水平明显增高，而且与其对应的Zip13蛋白表达水平亦显著升高(P<0.05)，见图3。

3 讨 论

近年来，细胞和分子水平的探索成为心力衰竭研究领域的热点[3]。锌维持细胞正常生理功能及发挥信号转导作用的前提是锌稳态[4]。锌稳态是指锌在机体内的浓度和分布处于相对稳定的动态平衡，该动态平衡被打破即锌稳态失衡。锌稳态失衡与多种心血管疾病包括缺血再灌注损伤有关[5]。锌的动态活性及其作为信号传递介质的作用是目前研究的热点。尽管锌离子本身具有氧化还原惰性，但是其对氧化还原状态的变化很敏感[6]。有研究显示，机体处于氧化应激状态下，锌会从细胞内如内质网、高尔基体等结合位点加速释放，有可能导致细胞内锌富集。这种锌聚集有可能潜在影响线粒体代谢，从而反馈性影响细胞的氧化还原状态。这些作用有可能是通过影响信号转导途径实现的[7]。

我们推测本研究观察到的锌胞内转运的原因之一是心肌需锌量增加，这很可能涉及和包括一些研究者定义的细胞内早期和晚期锌信号。早期锌信号快速且短暂，没有锌转运体的参与，不会对细胞内锌的浓度和分布造成本质改变即基本不会改变锌稳态[8]。晚期锌信号的作用则缓慢且持久，持续超过数小时的锌刺激才有可能引起细胞内锌浓度和分布的绝对变化，且主要是需要能量和复杂启动机制的锌转运体协助下锌的跨膜主动转运引起的，通常对细胞内锌稳态起决定作用[9]。本研究推测，LVDD心肌细胞内锌浓度可能先后经历了以上两个过程，且锌转运体Zip13可能参与了一系列复杂晚期锌信号的调控。

本研究中，两组大鼠均为正常锌饮食，饲料中锌的含量均为30 mg/kg。在没有额外的外源性锌摄取和补充的情况下，推测LVDD大鼠心肌细胞锌浓度升高的原因很有可能是某种机制促使细胞从血浆中以一定途径向细胞内转入了更多的锌。但也有研究认为，可能是机体外排锌的增加导致了细胞外锌浓度降低[10]。本研究认为尚不能完全确定LVDD大鼠血清中锌离子转移的方向，但我们的发现与以上两种观点并不矛盾。因为启动和调控机制的不同，以上关于锌转移的方向和途径很有可能是同时存在的。

以往研究显示，Zip13所属的Zip家族的作用是主动将细胞器或细胞外的锌离子向胞内释放或转运以增加细胞内锌离子浓度[11]。我们推测，LVDD心肌细胞处于压力诱发的应激状态，细胞内存在锌稳态失衡，通过某种途调控锌离子由心肌细胞外转移至细胞内的晚期锌信号发挥了抗氧化应激、抗炎的心肌保护作用，Zip13很可能参与了该过程并发挥了重要的载体和媒介作用[12-13]。Zip13与锌浓度升高即稳态失衡二者之间明确的因果关系和相互作用还存在很大争议，有待进一步阐明。STAT3信号通路和核因子(NF)-κB信号通路可能与具体的作用机制有关[14-15]。截至目前，至少有两种观点是存在的。第一种观点认为锌本身作为一种信号分子，心肌锌浓度的改变作为原因在先，Zip13感受锌信号后被动调控锌浓度[16-18]。第二种观点则认为Zip13表达增加可能是LVDD心肌病生理改变的适应性变化，即心肌细胞自身适应性调整。甚至有研究者认为，锌可能与Zip13无直接关系，即使二者有关，锌也并不是唯一导致Zip13表达增加的始动因素[19-22]。本研究结果更倾向于第一种观点。

本研究有一定局限性，从以下几个方面改进和完善是必要的：首先，增加外源性锌干预，如不同浓度梯度的外源性补锌和缺锌干预，以确证锌的作用；其次，增加对机体不同组织或细胞不同区域锌分布的检测，特别是增加机体外排锌的检测；最后，增加对Zip13本身的直接干预包括基因敲除等手段等，以明确锌与Zip13的相互关系和具体调控机制。同时，有必要将其他锌转运体一并纳入研究和筛选范围。通过以上改进和完善，以期明确LVDD中锌与Zip13的具体作用机制。