陈 琳，周经霞，曾超胜

0 引言

血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前已知最强的促血管生成因子，可以保护神经细胞、促进神经轴突再生，帮助缺血性脑组织恢复血供，是一个很有前景的治疗缺血性脑卒中的生物因子[1]。然而，VEGF在发挥治疗缺血性脑卒的作用时，会加重血脑屏障完整性的破坏，导致脑水肿等严重不良反应，阻碍VEGF的临床应用[2-3]。转录调控核因子-κB(NF-κB)通路是重要的炎性细胞因子调节通路，在脑卒中时处于激活状态，P65蛋白是NF-κB通路的核心蛋白，激活后入核发挥转录因子的作用，调节一系列基因的表达[4]。血清类黏蛋白(Orosomucoid，ORM)对于维持多个组织和器官毛细血管的通透性有重要作用，外源性给予ORM可以显著增强血脑屏障，其中ORM1占ORM的75%以上[5]。本研究观察VEGF 对血管内皮细胞ORM1表达的影响，并探讨NF-κB通路在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 人真皮微血管内皮细胞 (HDMEC)购自上海细胞生物研究所，内皮细胞生长补充因子(ECGS)、VEGF、DAPI和NF-κB通路抑制剂(PDTC)购于美国Sigma公司，Trizol和反转录试剂盒购自美国英韦创津公司、荧光定量PCR(Real-time PCR)试剂盒购自上海生工生物工程有限公司，ORM1和内参β-actin 引物由深圳华大基因公司设计和合成，见表1。细胞蛋白裂解液和细胞核蛋白提取试剂盒购自北京碧云天公司，内皮细胞培养基(ECM)和胎牛血清购于美国 Gibco 公司，ORM1、P65以及内参GAPDH、Histone抗体购自美国Abcam公司，MCO-20AIC型CO2培养箱购自日本 SANYO 公司，ABI 7500 型Real-time PCR仪为美国应用生物系统公司产品，Multiskan Spectrum酶标仪购自美国Thermo公司。

表1 引物序列表

1.2 细胞培养和传代 HDMEC细胞培养于5%胎牛血清、1%ECGS、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的ECM培养液中，置于5%CO2、37 ℃ 细胞培养箱，待细胞达到80%融合(对数生长期)时传代进行试验。……