王昌锦，赵燕杰，康占海，王金芳，刘细平，陶 婧，徐 妍*

(1.北京宇悦生物科技有限公司，北京 100085；2.河北农业大学，河北保定 200020)

吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)，化学名称为N-{2-[1-(4-氯苯基)-1H-吡唑-3-氧甲基]苯基}-(N-甲氧基)氨基甲酸甲酯，是巴斯夫于 1993年开发的目前活性最高的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂。该农药是全球第一个以“植物健康作用”登记的产品，其通过高效抑制病菌线粒体的呼吸作用并抑制病菌孢子萌发能力，从而发挥药效[1-2]。乙嘧酚(ethirimol)化学名称为 5-丁基-2-乙基氨基-4-羟基-6-甲基嘧啶，是由先正达公司开发的嘧啶类杀菌剂，可被植物根、茎、叶迅速吸收并快速运输到植物体的各个部位，从而达到保护的效果，其持效期较长[3-4]。

30%吡唑醚菌酯·乙嘧酚悬浮剂是由北京宇悦生物科技有限公司开发的杀菌剂品种，由20%的吡唑醚菌酯和10%的乙嘧酚复配而成。药效试验证明，它是一种高效广谱的杀菌剂，具有较高的生物活性和突出的增产作用，可用于防治子囊菌、担子菌、半知菌和卵菌纲真菌引起的多种病害，并通过抑制病原孢子侵入，全面控制白粉病病菌。该剂广泛用于防治小麦、水稻和蔬菜等农作物病害[5-6]。然而，目前有关该混剂产品同条件分析方法尚未见报道。基于此，本文利用反相高效液相色谱法，采取 C18反相柱以及紫外可变波长检测器，对有效成分进行了分析和定量。此方法同时适用于吡唑醚菌酯(乙嘧酚)原药以及制剂的分析，具有快捷简便、灵敏准确、重复性好的特点，适用于产品质量的检测分析。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260型高效液相色谱仪配有紫外检测器、自动进样器和Agilent色谱工作站。

水为新蒸二次蒸馏水；乙腈为色谱纯；吡唑醚菌酯标样：纯度≥99.0% (北京宇悦生物科技有限公司提供)；乙嘧酚标样：纯度≥99.0% (北京宇悦生物科技有限公司提供)；30%吡唑醚菌酯·乙嘧酚悬浮剂(北京宇悦生物科技有限公司提供)。

1.2 色谱条件

色谱柱：采用ZORBAX SB C18(150 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)；检测波长：235 nm；流动相：乙腈∶水=85∶15(体积比)；流速：1.0 mL/min；进样量：5 μL；柱温：30 ℃。在上述色谱条件下，吡唑醚菌酯和乙嘧酚的保留时间分别约为2.9 min和4.8 min (图1、图2)。

图1 吡唑醚菌酯和乙嘧酚标样液相色谱图

图2 30%吡唑醚菌酯·乙嘧酚悬浮剂试样液相色谱图

1.3 溶液配制

1.3.1 标样溶液的配制

称取吡唑醚菌酯标准品约 0.05 g、乙嘧酚标准品约0.1 g (精确至0.000 2 g)于100 mL容量瓶中，用流动相溶解后，用超声波脱气10 min，使标样全部溶解，冷却至室温，定容，摇匀备用。

1.3.2 试样溶液的配制

首先称试样0.5 g (精确至0.000 2 g)于100 mL的容量瓶中，用流动相溶解后，在超声波清洗器上脱气10 min，使试样全部溶解，冷却至室温，定容，摇匀，用0.22 μm有机滤膜过滤后备用。

1.4 测定

在上述色谱操作的条件下，待仪器基线稳定后，连续注入数针的标样溶液，计算各针的相对响应值，直至相邻 2针吡唑醚菌酯(或乙嘧酚)响应值的相对变化量小于1.2%时，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。用外标法计算各自含量。

1.5 计算

将测得的2针试样溶液以及试样前后2针标样溶液中的吡唑醚菌酯(或乙嘧酚)峰面积分别进行平均。试样中吡唑醚菌酯(或乙嘧酚)的质量分数w(%)按照下式计算：

式中：A1为标样溶液中吡唑醚菌酯(或乙嘧酚)峰面积的平均值；A2为试样溶液中吡唑醚菌酯(或乙嘧酚)峰面积的平均值；m1为标样质量，g；m2为试样质量，g；P为标样中吡唑醚菌酯(或乙嘧酚)的质量分数，%(m/m)；5为稀释因子。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 流动相的选择

流动相的选择是决定液相色谱分离效果的关键所在。通过试用不同比例的甲醇、水，乙腈、水作为流动相对试样进行分离检测。根据检测结果，采用乙腈、水作为流动相分离效果好，出峰时间短，且峰型尖锐，最终选定流动相的比例为乙腈∶水=85∶15(体积比)。

2.1.2 检测波长的选择

通过对吡唑醚菌酯和乙嘧酚进行紫外扫描，得到其相应的吸收波长与响应值的紫外吸收光谱图。当选用235 nm作为检测波长时，吡唑醚菌酯和乙嘧酚均有较强吸收峰，同时杂质响应值小，流动相无吸收。因此，为兼顾两者均有较好的吸收，将检测波长选为235 nm。

2.2 特异性的测定

本试验方法采用 HPLC-DAD峰纯度分析法来鉴别。吡唑醚菌酯HPLC-DAD中的最小峰纯度相似度均为1.000 000，最小峰纯度阀值为0.999 284，最小峰纯度指数为正值，说明样品色谱峰中不含有杂质峰；乙嘧酚HPLC-DAD中的最小峰纯度相似度为1.000 000，最小峰纯度阀值为0.999 486，最小峰纯度指数为正值，说明样品色谱峰中不含有杂质峰。标样液相色谱峰与试样液相色谱峰出峰时间差在1.0%以内，如图1和图2所示。制剂中峰纯度色谱图如图3和图4所示。

图3 制剂中吡唑醚菌酯HPLC-DAD峰纯度色谱图

图4 制剂中乙嘧酚HPLC-DAD峰纯度色谱图

2.3 线性相关性测定

配制吡唑醚菌酯(乙嘧酚)一系列不同质量分数的标样溶液，按照上述色谱操作条件，测定相应的响应值，并且以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，从而得到吡唑醚菌酯和乙嘧酚的线性相关性曲线。吡唑醚菌酯线性方程是：y=10 827x-1 781(图5)，相关系数为0.999 5；乙嘧酚的线性方程是：y=757 26x+436 942(图6)，相关系数为0.999 5。

图5 吡唑醚菌酯线性关系图

图6 乙嘧酚线性关系图

2.4 分析方法的精密度测定

在上述色谱操作条件下，对同一30%吡唑醚菌酯·乙嘧酚悬浮剂样品平行测定5次，吡唑醚菌酯和乙嘧酚的标准偏差分别为0.06和0.08，变异系数分别为0.58%和0.42%，结果见表1。

2.5 分析方法的准确度测定

称取5个已知质量分数的30%吡唑醚菌酯·乙嘧酚悬浮剂样品，分别加入一定量的吡唑醚菌酯和乙嘧酚标准品，按照上述色谱条件测定样品的吡唑醚菌酯和乙嘧酚总质量，并计算其平均回收率，结果见表 2。吡唑醚菌酯和乙嘧酚的平均回收率分别为100.03%和100.10%。

表1 30%吡唑醚菌酯·乙嘧酚悬浮剂分析方法的精密度试验结果

表2 30%吡唑醚菌酯·乙嘧酚悬浮剂回收率试验结果

2.6 非分析物干扰的试验

在评价准确度时，通常需要包含非分析物质的干扰，因为有效成分中的任何干扰物都会导致分析方法出现系统误差。而且，在分析时应同时测定不带有效成分的空白样品，或证明其无干扰。通过对溶剂(乙腈)、空白样品(不含有效成分的助剂)、原药等按分析方法1.2进行分析，溶剂(乙腈)、原药及不含有效成分助剂空白，对分析无干扰；分离度高于1.5%，因此均不影响相互定性定量分析；因此本文的分析方法未受到非分析物干扰。

3 结 论

本文建立了30%吡唑醚菌酯·乙嘧酚悬浮剂中有效成分的分析方法，此方法具有高精密度和高准确度的特点，其线性关系良好，试验操作简便，是进行在线产品质量检测较理想的分析方法。