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油用牡丹籽蛋白质的制备及理化性质研究

2020-06-08陈晓菲蔡建红刘晓燕任伟伟

实用药物与临床 2020年3期
关键词:油用液料分子量

陈晓菲,蔡建红,刘晓燕,任伟伟

0 引言

油用牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)属毛茛科芍药属牡丹组木本植物。牡丹籽含油量20%以上;油脂中不饱和脂肪酸含量为80%~92%,其中α-亚麻酸含量为32%~67%,亚油酸含量为19%~35%[1-2],牡丹籽油已被原国家卫生部批准为新资源食品。随着近几年我国油用牡丹种植面积的急剧扩大,油用牡丹产业蓬勃发展,随之产生了大量的牡丹籽粕。牡丹籽粕蛋白质含量达25%,营养丰富[3]。因此,对牡丹籽粕蛋白进行研究,促进其精深加工与应用,具有极高的经济价值和极大的营养保健价值[4]。

本文利用碱提酸沉提取牡丹籽蛋白质,并对提取工艺进行正交优化,同时就牡丹籽蛋白的理化性质进行研究,以期为牡丹籽的研究与开发提供理论基础。

1 仪器与试药

牡丹籽购买于山东菏泽尧舜牡丹生物技术有限公司,经南京中医药大学生药学教研室鉴定为毛茛科芍药属牡丹的种子;考马斯亮蓝G250(北京索莱宝科技有限公司);氢氧化钠等其他试剂为分析纯。WF-万能粉碎机(江阴市康和机械制造有限公司);紫外分光光度计UV7[梅特勒-托利多,国际贸易(上海)有限公司];pHS-3C酸度计(上海雷磁仪器有限公司);JY-SCZ2型双垂直电泳槽(北京君意东方电泳设备有限公司);DYY-6C电泳仪(北京市六一仪器厂)。

2 方法

2.1 提取工艺流程 牡丹籽适当粉碎,95%乙醇脱脂,减压过滤后晾干备用。精密称取脱脂牡丹籽适量,加蒸馏水混匀,调节pH值至碱性,水浴加热提取,离心,取上清,调节pH值至酸性,离心,弃上清,用蒸馏水洗涤沉淀至中性,冷冻干燥,即牡丹籽粗蛋白[4]。

2.2 蛋白质含量测定 分别精密移取牛血清蛋白标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 ml于试管中,补蒸馏水至1.0 ml,混匀,加5.0 ml考马斯亮蓝G250溶液,摇匀,静置5 min,595 nm处测定吸光度。以蛋白标准溶液浓度(mg/ml)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线。以蛋白质含量(mg)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标,绘制标准曲线。通过线性回归得出方程为:Y=7.793 1 X+0.015 2,线性范围为0~0.09 mg/ml,相关系数r=0.999 6。

2.3 单因素考察与正交优化 称取2.0 g牡丹籽干粉若干份,分别选取液料比[10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1(ml/g)]、提取时间(35、40、45、50、55 min)、pH值(9.0、9.5、10、10.5、11)、提取温度(30、35、40、45、50 ℃)进行单因素试验。在单因素试验基础上,采用正交试验优化牡丹籽蛋白的提取工艺。

2.4 牡丹籽蛋白质理化性质研究

2.4.1 牡丹籽蛋白质红外色谱 取冷冻干燥牡丹籽蛋白质样品适量,与干燥KBr粉末充分研磨后压片,于4 000~400 cm-1波段扫描。

2.4.2 牡丹籽蛋白质的分子量 目前测定蛋白质相对分子量常用的技术之一为SDS-PAGE电泳,按照Laemmli法[5]进行凝胶电泳,确定牡丹籽蛋白质相对分子量。电泳条件为:5%浓缩胶,12%分离胶,采用200 mA电流,进行2.5 h。

3 结果与讨论

3.1 单因素试验结果

3.1.1 液料比对蛋白质提取量的影响 液料比对于牡丹籽蛋白质的提取量具有十分关键的影响。液料比过大,可能造成蛋白质的提取率降低;且其余杂质也容易一起提取出来,从而影响蛋白质纯度,加大后续纯化的难度。若液料比过小,容易出现蛋白质提取不充分的情况[6]。因此,本实验在pH值为9、提取温度50 ℃、提取时间50 min的条件下,考察液料比对牡丹籽蛋白质提取量的影响。如图1所示,在料液比为10∶1~30∶1(ml/g)时,牡丹籽蛋白质提取量随提取溶剂体积的增加而增大,当液料比为30∶1(ml/g)时,牡丹籽蛋白质提取量达到最大;随着溶剂体积继续增加,牡丹籽蛋白质提取量基本保持不变。

3.1.2 提取时间对蛋白质提取量的影响 提取时间是影响蛋白质提取量的重要因素之一。若提取时间过短,容易出现蛋白质提取不充分的情况,造成资源的浪费。若提取时间过长,可能会导致蛋白质的结构发生改变,影响蛋白质的提取率和稳定性。因此,在pH值为9、提取温度50 ℃、液料比30∶1(ml/g)的条件下,考察提取时间对牡丹籽蛋白质提取量的影响。如图2所示,在35~45 min内,蛋白质提取量随提取时间增加而增大,在提取时间为45 min时,提取量达到最大。当提取时间超过45 min后,牡丹籽蛋白质提取量逐渐降低。

图1 液料比对蛋白质提取量的影响

图2 提取时间对蛋白质提取量的影响

3.1.3 pH值对蛋白质提取量的影响 由图3可知,在一定pH值范围内,牡丹籽蛋白质提取量随pH值升高不断增大,当pH值超过10.0时,蛋白质含量下降,可能因为随溶液pH值的升高,改变了蛋白质表面带电情况。在碱性溶液中,蛋白质所带负电荷增加,影响了蛋白质与溶剂之间或者蛋白质分子与分子之间的相互作用,影响其溶解性[7]。

3.1.4 提取温度对蛋白质提取量的影响 提取温度是影响蛋白质提取量的重要因素之一。若提取温度过低,则蛋白质提取效率较低。若提取温度过高,致蛋白质的结构发生变性,影响蛋白质的生物活性和稳定性[8]。因此,在pH值为9、液料比30∶1(ml/g)、提取时间50 min的条件下,考察提取温度对牡丹籽蛋白质提取量的影响。如图4所示,在提取温度为30~40 ℃,牡丹籽蛋白质提取量随温度增加不断增大,温度超过40 ℃,蛋白质含量降低。

图3 pH值对蛋白质提取量的影响

图4 提取温度对蛋白质提取量的影响

3.2 正交试验结果 由表1~表3可知,以牡丹籽蛋白质提取量为指标,影响提取牡丹籽蛋白质提取量的4个因素中,液料比影响最大,其次是提取时间、提取温度,pH值影响最小,即C>B>D>A。牡丹籽蛋白质提取较优方案为A3B1C2D2,即pH值为10.5,提取40 min,液料比25∶1(ml/g),提取温度40 ℃。

表1 牡丹籽蛋白质提取工艺因素水平表

3.3 牡丹籽蛋白质理化性质研究

3.3.1 牡丹籽蛋白质红外色谱分析 由图5可知,在3 395.79 cm-1强而宽的吸收峰为N-H键的伸缩振动,在2 933.19 cm-1处吸收峰为费米共振,在1 655.68 cm-1处强吸收峰为C=O键的伸缩振动,1 536.10 cm-1处为N-H弯曲振动和C-N伸缩振动吸收峰,1 322.25、1 281.50、1 238.61 cm-1处为C-N和N-H弯曲振动吸收峰,594.82 cm-1处吸收峰为C=O面外弯曲振动吸收峰。

表2 L9(34)正交实验结果

表3 方差分析

注:F0.05(1,2)=19

图5 牡丹籽蛋白质红外色谱图

3.3.2 牡丹籽蛋白质的分子量 牡丹籽蛋白质的分子量主要集中在66.2~18.4 kDa范围内,主要有66.2~45.0 kDa和25.0~18.4 kDa 3条带组成,牡丹籽蛋白质的分子量大约为55、51、22 kDa。

见图6。

图6 牡丹籽蛋白质SDS-PAGE电泳图

4 结论

本研究结果表明,牡丹籽蛋白质提取的最佳工艺条件为pH 10.5,提取40 min,液料比25∶1(ml/g),提取温度40 ℃,研究发现,牡丹籽蛋白质的分子量主要集中在66.2~18.4 kDa,为牡丹籽蛋白质的开发与利用提供基础。

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