文 /陶文靖 董彬 赵婷婷 付敏 胡素丽

优化试剂盒参数，快速检测牛奶中抗生素生物 // 本文主要对芽孢萌发培养基成分、指示剂、pH值、芽孢包埋量、罐装量等影响芽孢萌发产酸的条件进行优化，确定了芽孢萌发培养基最佳配比为蛋白胨1.0%、葡萄糖0.5%、琼脂0.5%、CMC 0.2%；芽孢萌发最佳条件为溴甲酚紫40 mg/L、pH值为7.0；以及试剂盒生产所需芽孢最佳包埋量为1×l07CFU/mL。根据优化后的条件，进行生产检测试剂盒，并测定试剂盒的灵敏度与稳定性。

上世纪50年代，荷兰的DSM公司开发生产了一批试剂盒，目前DSM公司的试剂盒检测法已经成为全球公认的乳品抗生素残留的检测方法，也是荷兰、法国等国家乳品抗生素残留的标准检测方法。试剂盒检测法是利用微生物抑制法原理，微生物抑制实验的原理是基于对微生物生理学和代谢抗生素的抑制作用，可以定性确定样品中的抗生素残留是否超过标准。其检测方法是在96孔检测板的微孔中加入含嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢和pH指示剂的培养基，在60-65℃条件下培养，指示剂由紫色变为黄色。

表1 抗生素种类及浓度

实验部分

仪器和试剂

仪器设备：超净工作台、pH测试计、电子天平、灭菌锅、干式加热器、磁力搅拌器、恒温培养箱、显微镜。

试剂：蛋白胨、酵母粉、琼脂粉、葡萄糖、溴甲酚紫、氢氧化钠、屈臣氏无菌蒸馏水、不同种抗生素标准品。

样品：无抗奶样。

实验方法

1.抗生素样本的制备

选择无抗奶，按照表1所示，添加不同浓度抗生素制成实验样本。

2.芽孢萌发条件及试剂盒参数的优化

芽孢可以保持很长的休眠期，也可以在外界刺激下打破休眠而萌发成营养体，快速生长。通过优化培养基成分、pH值、菌株包埋含量、培养温度等以促进孢子萌发，并筛选变色灵敏的显色剂，来提高试剂盒检出灵敏度。

根据查阅资料，设置基础培养基配比为蛋白胨0.5%、葡萄糖0.3%、琼脂1.5%、CMC 0.1%；选择溴甲酚紫为显色剂，pH值为7.0；包埋量为1×l07CFU/mL；罐装量100μL/孔，在此条件下进行优化。目标是在加样本后2.5-3 h反应内，可以检测出目标抗生素。检出限参考Delvotest®试剂盒。

■包埋培养基营养成分的优化

设置4种培养基，将活化好的菌株接种到配置好的培养基上，在65℃的条件下，培养8 h后，开始每隔2 h观察每个培养基上菌落大小来判断菌落的生长速度。将培养基罐装到微孔板中，在65℃下，孵育3 h，根据培养基变色的时间来判断产酸效果，从而确定最佳培养基成分配比。4种培养基设置如下：

培养基1：蛋白胨0.5%、葡萄糖0.3%、琼脂1.5%；

培养基2：蛋白胨1.0%、葡萄糖0.3%、琼脂1.0%；

培养基3：蛋白胨1.0%、葡萄糖0.5%、琼脂0.5%、CMC 0.2%；

培养基4：蛋白胨1.5%、葡萄糖0.5%、琼脂0.5%、CMC 0.1%；

■包埋显色剂的优化

芽孢包埋浓度设置为：1×l07CFU/mL，pH 值为 7.0，按照100 μL/孔进行罐装，分别加入100μL无抗奶和表1所示的100μL加标奶，在65℃下，孵育3 h后，测试灵敏度。溴甲酚紫含量 设 置：20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L、100 mg/L。

■芽孢包埋浓度的优化

包埋浓度分别设置为：1×l05CFU/mL、1×l06CFU/mL、1×l07CFU/mL、1×l08CFU/mL、1Xl09CFU/mL 。按照 100 μL/孔进行罐装，分别加入100 μL无抗奶和各种浓度的加标奶，在65℃下，孵育3 h，观看颜色变化，以抗生素检测灵敏度（考虑最接近国标检出限）来确定芽孢包埋最佳浓度。

3.试剂盒灵敏度的测定

根据上述优化后参数，生产一批试剂盒，进行灵敏度测定实验。根据上述要求配置待检测奶样，添加100 μL奶样至微孔中，在65℃下，孵育3 h，判断试剂盒灵敏度范围。

结果与分析

1.包埋培养基营养成分的确定

依照培养基各种成分配比，包埋培养基营养成分的优化的实验方案进行实验，结果如表2、表3所示。

由表2、表3所示，在相同的时间内，以菌落生长的数目和状态反应菌株的生长速度，以产酸效率反应菌落生长速度。最终可以确定最佳包埋培养基成分为蛋白胨1.0%、葡萄糖0.5%、琼脂0.5%、CMC 0.2%。

2.显色剂含量的确定

依照包埋显色剂的优化的实验方案，结果如表4、表5所示。

指示剂的添加量对包埋培养基颜色变化有一定的影响。随着溴甲酚紫含量的提高，检测变色效果逐渐提高，灵敏度提高，但要综合考虑到国标对抗生素残留检出限的要求，由表4、表5所示，综合变色时间和检测灵敏度两个因素，可以判断溴甲酚紫最佳含量为40 mg/L。

3.芽孢包埋浓度的确定

依照芽孢包埋浓度的优化的实验方案，在相同的包埋培养基中加入不同含量菌液，制备试剂盒，进行抗生素检测实验，结果如表6和图1所示。

由表6所示，在一定范围内，随着芽孢包埋量的增加，对5种抗生素的检测灵敏度不断提高，也逐渐趋于稳定，综合考虑灵敏度效果和国标检出限要求，最佳芽孢包埋量为在1×l07CFU/mL 。

4.试剂盒检测限的确定

以蛋白胨1.0%、葡萄糖0.5 %、琼脂0.5%、CMC 0.2%，甲酚紫含量40 mg/L、pH值为7.0，芽孢包埋量1×l07CFU/mL ，罐装量为130 μL/孔，小试生产一批试剂盒，根据上述要求配置待检测奶样，添加100 μL奶样至微孔中，在65 ℃下，孵育3 h，判断试剂盒灵敏度范围，结果如表7和图2所示。

表2 四种培养基上产酸结果

表3 四种培养基上菌落生长速度

表4 溴甲酚紫含量对产酸变色效果的影响

表5 溴甲酚紫含量对试剂盒灵敏度的影响

表6 芽孢包埋量对试剂盒灵敏度的影响

由表7和图2所示，经过条件优化，初步测定试剂盒的检出限，分别是青霉素2 μg/L、磺胺嘧啶100 μg/L、强力霉素150 μg/L、林可霉素150 μg/L、头孢氨苄100 μg/L。跟 Devotest®试剂盒无显著差异。

结论与讨论

本文主要对芽孢萌发培养基成分、指示剂、pH值、芽孢包埋量、罐装量等影响芽孢萌发产酸条件等进行优化，最终确定最佳条件为蛋白胨1.0%、葡萄糖0.5% 、琼脂0.5%、CMC 0.2%，溴甲酚紫含量40 mg/L、pH值为7.0，芽孢包埋量1×l07CFU/mL，罐装量为130 μL/孔。

通过对五大类抗生素添加样检测，初步确定试剂盒的灵敏度。根据检测结果发现，试剂盒可以检测出5大类抗生素，但灵敏度还需要提高，对5大类抗生素包涵的其它小类还需要进一步进行验证，确定不同种抗生素的检测范围。

图1 不同浓度青霉素检测结果

图2 5种不同抗生素检测结果

表7 试剂盒灵敏度检测结果