马子力，黄兴龙，冯剑英，姚元贵，刘春艳，张 卫，胡欣悦，张丽艳*，马四补*

(1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2.赤水市人民医院，贵州 赤水 564700)

忍冬叶为忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属(Lonicera)植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥叶，是传统中药金银花基源植物的叶[1]，该药材分布于中国绝大多数地区，如山东、河南、贵州、云南、山西、河北等地[2]。金银花应用历史悠久，因其性甘寒气芳香，清热而不伤胃，芳香透达可祛外邪，自古就被称为清热解毒的良药[3]，具有清热解毒、疏散风热、保肝利胆、抗病毒等多种药理作用[4]。由于金银花清热解毒效果显著，已被列为抗病毒的常用药[5]，其市场需求量大，价格居高不下，亟需新的药材替代品。目前《中国药典》中仅收录了金银花、忍冬藤，还未对忍冬叶进行深入研究，笔者通过查阅大量医学典籍发现，忍冬叶的应用历史同样悠久，在晋代《肘后备急方》中有“忍冬茎叶挫数壶煮”[6]的描述，表明茎叶同样是该药材的药用部位。忍冬在生长阶段，忍冬叶的产量高于花的10倍左右[7]，但忍冬叶多数情况下未作为药用部位而被遗弃[8]。临床研究表明，使用鲜忍冬叶泡茶，急性肠炎患者可以在3天内被治愈[9]。张宁等[10-12]通过研究发现，忍冬叶粗提物具有良好的抑菌、抗氧化等活性忍冬叶片因具有较高的产量，黄酮、绿原酸等多酚类物质含量丰富，抗氧化、抑菌等药理作用较明显，目前已广泛应用于各种中成药及饮品中[13-16]。鉴于忍冬叶的广泛应用，迫切需要建立忍冬叶HPLC指纹图谱科学全面反映忍冬叶质量标准[17]，同时可为黔产忍冬叶载入地方标准提供实验基础和科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

安捷伦1260型高效液相色谱仪(安捷伦公司)；METTLER TOLEDO XSE105DU型十万分之一电子分析天平(梅特勒公司)；FA1104型电子分析天平(上海方瑞公司)；US-1.3D型超声波清洗器(中科仪仪器有限公司)。

1.2 试药

甲醇(色谱纯，天津四友公司)；乙腈(色谱纯，天津四友公司)；甲醇(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；纯净水(娃哈哈集团有限公司)；磷酸(分析纯，南京化学试剂有限公司)；木犀草苷对照品(供含量测定11720-201609，纯度≥98%)、绿原酸对照品(供含量测定110753-201415)均购自于中国食品药品检定研究院。

样品于2017年采自贵州省各区县，阴干。药材经贵州中医药大学植物栽培教研室魏升华教授鉴定为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThund.的干燥叶。药材信息见表1。

表1 药材来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Phenyl(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；流动相：以乙腈-0.5%甲酸梯度洗脱(见表2)；检测波长：350 nm；柱温：35 ℃；进样量10 μL。分别吸取溶液和供试品溶液各 10 μL，注入高效液相色谱仪进行分析，在拟订色谱条件下，供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上有相应的色谱峰，经二极管阵列检测器纯度测试，二者一致，各色谱峰均达到了基线分离。

表2 梯度洗脱条件

2.2 供试品及对照品溶液制备

样品溶液制备：精密称定药材粉末(过四号筛)1 g于具塞锥形瓶中，加入80%甲醇50 mL，称定重量，超声60 min再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，精密量取20 mL样品溶液挥发至干，再用80%甲醇定容至5 mL容量瓶中，并经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

对照品溶液的制备：精密称取绿原酸标准品15.26 mg、木犀草苷标准品10.41 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，精密加入80%甲醇，定容至刻度，摇匀，即得。

2.3 方法学考察

精密度试验：取忍冬叶药材(P1)1 g，精密称定，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，同时按“2.1”项下的色谱条件连续6次进样测定。以绿原酸为参照峰，对特征图谱中各共有峰的相对保留时间及相对峰面积值进行计算。结果表明，在特征图谱中，各共有峰的相对峰面积及相对保留时间的RSD值均小于3%，表明仪器精密度良好。

重复性试验：取忍冬叶药材(P1)1 g，精密称定，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，同时按“2.1”项下的色谱条件测定，连续进样6次，记录特征图谱中各共有峰的保留时间及峰面积。以绿原酸为参照峰，计算特征图谱中各共有峰的相对保留时间及相对峰面积。结果表明，在特征图谱中，各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值均小于3%，表明该方法重复性良好。

稳定性试验：取忍冬叶药材(P1)1 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，同时按“2.1”项下的色谱条件，于0、3、5、9、15、20 h内测定同一供试品溶液，记录特征图谱中各共有峰的保留时间及峰面积。以绿原酸为参照峰，计算特征图谱中各共有峰的相对保留时间及相对峰面积。结果表明，在特征图谱中，各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值均小于5%，表明供试品溶液20 h内稳定性良好。

2.4 指纹图谱共有指纹峰标定

根据特征图谱中10批样品的测定结果，运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012A版软件进行分析。确定了指纹图谱16个共有峰(图1)。绿原酸是忍冬叶中的主要有效成分之一，因此，以3号峰(绿原酸)为参照峰，将“2.2”项下的混合对照品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进行测定，再与特征图谱进行保留时间的对比分析，最终指认了3号峰为绿原酸、10号峰为木犀草苷(图2)。各峰相对保留时间、相对峰面积结果如下(表3、表4)。

图1 10批忍冬叶特征图谱共有峰模式色谱

图2 特征图谱共有峰指认色谱(绿原酸、木犀草苷)

表3 10批次忍冬叶相对保留时间

表4 10批样品共有峰相对峰面积

2.5 指纹图谱相似度检验

运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012.A版，采用中位数法计算10批样品成分指纹图谱的相似度，结果显示，10批样品的相似度和对照指纹图谱(R)相似度均在0.9以上，表明样品整体之间的相似度较高，结果如下表5。

表5 10批忍冬叶样品相似度评价结果

注：S1～S10分别对应药材批号P1～P10；R为对照指纹图谱。

3 讨论

本研究前期考察了水浴回流、超声等提取方法、80%甲醇、80%乙醇等提取溶剂及超声提取时间进行考察，得到80%甲醇，超声提取60 min所呈现的色谱峰信息较丰富，且各峰的分离度较好。此外本研究同时对液相色谱条件进行考察，通过考察乙腈-0.5%甲酸、乙腈-0.5%冰醋酸、乙腈-0.5%磷酸等三种流动相，其结果显示，乙腈-0.5%甲酸、乙腈-0.5%冰醋酸所呈现出的色谱峰信息较丰富，且分离度较好，但乙腈-0.5%甲酸所呈现出峰形较好，故最终选择乙腈-0.5%甲酸作为流动相。最后在其他色谱条件固定的条件下，对特征图谱的柱温(30 ℃、35 ℃、40 ℃)进行考察。结果显示：在不同的柱温下，除了各色谱峰的保留时间和分离度有差异以外，其峰面积无明显区别，而35 ℃情况下各色谱峰分离度较好，故选择柱温为35 ℃。

综上所述，本研究采用HPLC-DAD法，建立了10批忍冬叶指纹图谱检测方法，通过供试品溶液制备方法及色谱条件的考察，且对比不同波长下色谱峰的出峰情况及分离度，最终建立了忍冬叶的特征图谱，并经方法学验证，结果该方法精密性、稳定性、重复性均良好，表明该方法稳定可靠。以《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012.A版软件对不同产地的10个批次的样品进行分析，确定了忍冬叶成分共16个共有峰，并且用对照品指认了2个共有峰，确定3号峰为绿原酸、10号峰为木犀草苷。绿原酸、木犀草苷为忍冬叶的主要指标成分，且出峰时间较稳定，分离度较好。从忍冬叶指纹图谱相似度结果分析，10批忍冬叶指纹图谱的相似度大于0.9，指纹图谱全貌基本一致，说明不同批次忍冬叶化学组成一致，可为忍冬叶药材质量标准的建立及该药材质量的客观评价提供实验依据。