黎 明 李 勇 黄 召 唐湘莲 刘 赞 周宇翔 文佳冰 向强兴

肝母细胞瘤(hepatoblastoma，HB) 是婴幼儿最常见的胚胎源性肝脏肿瘤，多发生于3岁以下婴幼儿，占儿童原发肝脏恶性肿瘤的80%[1]。该病发展迅速，瘤体生长迅速，恶性程度高，易发生浸润和侵袭转移，目前多采用手术联合化疗的多学科综合治疗方案[2]。由于术后残留、复发，对化疗药物的不耐受及耐药性等问题一直未得到有效解决，因此寻找安全、低毒的化疗药物是目前国内外研究热点之一[3]。目前有关PI3K激酶小分子抑制剂的研究已经成为肿瘤学研究的热点，但是有关靶向亚型的小分子抑制剂对肝母细胞瘤效应的研究较少。因此，本研究将采用新型的小分子抑制剂Serabelisib，通过靶向PI3K/Akt信号通路，探讨其对于肝母细胞瘤细胞增殖、凋亡的作用，同时检测相关的分子机制，为肝母细胞瘤的治疗寻找新的药物和途径，并为Serabelisib治疗肝母细胞瘤的临床前研究提供实验依据和理论基础。

材料与方法

一、细胞系与试剂

人肝母细胞瘤细胞系HepG2由本实验室保存[4]。Serabelisib、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO) 购自美国Selleck公司；胎牛血清购自美国Gibco 公司； DMEM高糖培养基、胰酶购自美国HyClone 公司；四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)购自美国Sigma公司，PBS缓冲液配制成5 mg/mL储存液，0.22 μM滤膜过滤除菌，分装后于-20℃避光保存；Annexin V-FITC/PI apoptosis kit购自联科生物公司；FACS Calibur流式细胞仪购自美国BD公司； 针对89KD PARP裂解片段的cleaved-PARP抗体、Akt抗体及p-Akt抗体购自美国Cell Signaling公司；β-Actin 抗体购自美国Santa Cruz公司；SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate trial kit(34079)购自美国Thermo公司。显影剂、定影剂和X 光片均购自日本柯达公司。

二、实验方法

(一)HepG2细胞培养及Serabelisib的配制

HepG2细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养。细胞经0.25%胰酶消化传代，取对数生长期的细胞进行培养。Serabelisib先用DMSO配成原液，分装冻存，临用时细胞培养基稀释成所需浓度，DMSO终浓度为0.1%。

(二) MTT 比色法

调整处于对数期细胞悬液的浓度，将HepG2细胞接种在96孔板上(每孔100 μL)，12 h后加入不同浓度Serabelisib并处理不同时间； 加入MTT(每孔10 μL)，37℃、5% CO2培养4 h；1 800 rpm离心5 min，小心弃上清，加入DMSO溶解各孔MTT代谢产物，酶标仪内震荡孵育10 min，检测492 nm波长下吸光度值(A)。细胞生长抑制率(%)=[1-(处理组A均值/对照组A均值)]×100%；细胞活性(%)=(处理组A均值/对照组A均值)×100%。重复实验3次，取平均值，计算标准差。

(三)细胞凋亡测定

将HepG2细胞接种在6孔板上，12 h后加入不同浓度Serabelisib处理48 h后，使用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒。收集细胞于离心管中，1 000 rpm离心5 min，加入500 μL 1×结合缓冲液、5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI 混匀，避光孵育20 min，流式细胞仪进行检测，使用Cellquest软件进行结果分析。

(四)Western blot检测相关蛋白

HepG2细胞以不同浓度Serabelisib处理48 h后，以蛋白裂解液裂解细胞，提取上清液即为总蛋白，按照BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度。99℃、10 min加热变性后，进行10%SDS-PAGE凝胶电泳。然后将蛋白质转移置PVDF膜上，封闭、孵育一抗、二抗，X光片曝光、显影、定影显示目标条带。使用NIH ImageJ软件对条带进行密度分析。

三、统计学处理

结 果

一、 Serabelisib对HepG2细胞增殖的抑制作用

为证实小分子抑制剂Serabelisib对人肝母细胞瘤细胞株的抑制作用，以不同浓度Serabelisib(0 μmol/L，2 μmol/L，4 μmol/L，8 μmol/L)处理人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞24 h、48 h、72 h，以MTT法检测细胞活性，并计算细胞生存率。结果显示随着浓度的升高，Serabelisib对于细胞增殖的抑制作用增强，且抑制作用呈剂量和时间依赖性(图1)。

二、Serabelisib对HepG2细胞凋亡的影响

不同浓度Serabelisib(0 μmol/L，2 μmol/L，4 μmol/L，8 μmol/L)处理人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞48 h后，以Annexin V-FITC/PI 双标法检测细胞早期凋亡率和晚期凋亡率。发现HepG2细胞早期和晚期凋亡率均随Serabelisib浓度增加而增加，呈明显剂量依赖性(图2)，实验重复3次，取均值和标准差。细胞凋亡趋势与MTT结果相一致。提示Serabelisib对人肝母细胞瘤细胞具有抑制作用，可能与其诱导细胞凋亡有关。

图1 Serabelisib抑制人肝母细胞瘤细胞系的增殖。HepG2细胞以104个细胞/孔种植于96孔板，不同浓度Serabelisib(0 μmol/L,2 μmol/L,4 μmol/L,8 μmol/L)处理不同时间(24 h，48 h，72 h)后，以MTT法检测细胞活性。平行3孔，柱状图表示生存率和标准差。*表示与对照组(0 μmol/L)相比P<0.05

Fig.1 Serabelisib inhibited cellular growth of human hepatoblastoma cell lines

三、Serabelisib抑制HepG2细胞中Akt磷酸化及促进PARP的裂解

Akt的本质是大小为56kD的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，处于PI3-K信号转导通路的核心部位。Akt在PI3-K等作用下发生磷酸化后充分活化，其磷酸化水平反映信号通路活化水平。PARP (polyADP-ribose polymerase)是一种DNA修复酶，为Caspase的催化底物，可被催化为89KD和24KD的裂解产物而失活，其裂解片段是细胞凋亡的分子标志之一。为进一步证明Serabelisib可以抑制PI3K-Akt信号通路并且诱导HepG2细胞凋亡，我们用Western印迹检测了Serabelisib作用下HepG2细胞株Akt蛋白磷酸化水平及PARP裂解产物水平的变化。结果显示，Serabelisib抑制Akt激酶磷酸化水平存在剂量依赖性，提示该小分子抑制剂可以抑制PI3K/Akt信号通路活性；而PARP 89KD裂解片段随Serabelisib浓度增加而增加，呈剂量依赖性(图3)。

讨 论

肝母细胞瘤(hepatoblastoma，HB) 是婴幼儿最常见的胚胎源性肝脏肿瘤，其主要形成机制是在胚胎发育期间，由肝脏内的多能干细胞分化增殖产生恶性肿瘤细胞，多发生于3 岁以下婴幼儿，占儿童原发肝脏恶性肿瘤的80%[1,2]。目前的治疗手段主要是手术联合化疗。HB治愈率在80%左右，而剩余20%的侵袭性更强的肿瘤对化疗基本没有反应，这些患者的预后很差，但是由于术后残留、复发，患者对化疗药物的不耐受及耐药性等负面效应一直存在[3,5]。

图2 Serabelisib诱导HepG2细胞系凋亡，呈明显剂量依赖性 注 A:HepG2细胞以不同浓度Serabelisib处理48 h后，Annexin V和PI染色后，流式细胞仪检测细胞凋亡率。本组图片为其中1次检测结果，分别标识早期凋亡(Annexin V-FITC+/PI-)和晚期凋亡(Annexin V+/P+)和完全坏死细胞(Annexin V-FITC-/PI+)比例; B:柱状图表示早期凋亡和晚期凋亡细胞总比例，为3次实验平均值，bar表示标准差。*表示与对照(0 μmol/L)相比P<0.05

Fig.2 The apoptosis of HepG2 cell line was induced by Serabelisib in a dose-dependent manner

图3 Serabelisib抑制人肝母细胞瘤细胞PI3K/Akt信号通路活性及促进凋亡相关蛋白表达 注 A:HepG2细胞以不同浓度Serabelisib(0 μmol/L，2 μmol/L，4 μmol/L，8 μmol/L)处理48 h后，提取细胞总蛋白，Western blot检测p-Akt、T-Akt 及PARP 89KD裂解产物，以β-actin作为上样量参照。条带使用ImageJ软件进行扫描并分析; B:采用NIH ImageJ软件分析各条带灰度值，并与β-actin进行比较

Fig.3 Serabelisib inhibited the activity of PI3K/Akt signaling pathway and promoted the expression of apoptosis-related proteins in HepG2 cells

目前HB的发病机制尚不清楚，除了肿瘤遗传学事件的发生，肝母细胞瘤的发生、增殖、侵袭与转移同样离不开环境中的各种生物信号，信号转导通路的异常也被认为是肝母细胞瘤的发病机制之一。近期研究表明，PI3K-Akt通路是一个经典的促增殖、抑凋亡的信号转导途径，在促进肿瘤细胞的生长、增殖，抑制细胞凋亡，促进细胞侵袭和转移，促进血管生成，抵抗化疗和放疗中细胞的凋亡上均发挥重要作用，该信号通路的所有成员(包括Akt)被认为是单一治疗或联合治疗的靶点用于治疗各种癌症，阻断PI3K/Akt信号转导通路的异常活化成为肿瘤治疗的新靶点[6-10]。

凋亡是细胞程序化死亡的过程，发生在细胞老化过程中，在正常组织的动态平衡和发育中起着重要作用[11]。细胞凋亡是一种重要的抗肿瘤途径，多种抗肿瘤药物通过诱导细胞凋亡在肿瘤中发挥重要作用，在癌变过程中诱导细胞凋亡被认为能有效减缓癌症的进展[12,13]。PARP(polyADP-ribose polymerase)是一种DNA修复酶，为Caspase的催化底物，可被催化为89KD和24KD的裂解产物而失活，其裂解片段也是细胞凋亡的分子标志之一[14]。Akt是大小为56kD的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，处于PI3-K信号转导通路的核心部位。Akt在PI3-K等作用下发生磷酸化后充分活化，其磷酸化水平反映了信号通路活化水平[15]。细胞凋亡的激活受多种信号通路的调控，其中PI3K/AKT通路是最重要的信号通路之一[16]。

研究表明，PI3K/Akt信号通路异常活化在肝母细胞瘤的发生发展中起着重要作用[17,18]。有研究表明肝母细胞瘤中存在PI3Kα亚基突变，从而导致激酶活性增加。通过 PI3K体外抑制和随后的Akt和GSK3β磷酸化的减少证实PI3K/Akt信号通路的异常活化是肝母细胞瘤细胞存活的关键[17]。

Serabelisib(INK-1117，mLN-1117，TAK-117)是一种新型的、有效的、具有高度选择性并且可采用口服的PI3Kα抑制剂[19]。Serabelisib可有效抑制PI3Kα的活性，其选择性比其他Ⅰ类PI3K家族成员高100倍以上。对携带有PIK3α突变的肿瘤细胞系进行Serabelisib处理，细胞内PI3K信号通路被有效抑制，细胞增殖阻滞并引起细胞凋亡，并且有效抑制肿瘤细胞的增殖，抑制胞内Akt的磷酸化和活性。Serabelisib单用或者与其他抑制剂联合应用已经在非血液系统恶性肿瘤、胃癌、乳腺癌、肾肿瘤及非小细胞肺癌在内的实体瘤中进行了体外及临床研究，疗效得到了肯定[9,19,20]。

目前PI3K激酶小分子抑制剂的研究已经成为肿瘤学研究的热点，但是靶向亚型的小分子抑制剂对于肝母细胞瘤效应的研究较少。本研究发现，PI3Kα特异性的小分子抑制剂Serabelisib可以抑制肝母细胞瘤细胞系细胞的增殖，诱导其凋亡，并呈剂量依赖性，其分子机制涉及到抑制PI3K/Akt信号通路及PARP的裂解失活；后续我们将在其他HB细胞系及体内实验进一步验证该小分子抑制剂的作用，为Serabelisib用于肝母细胞瘤治疗的临床前研究提供实验依据和理论基础。