谭嘉琦，韩秀清，成思琼，吴云锋，郝兴安

(1.西北农林科技大学，陕西杨凌 712100；2.陕西新世界果业集团有限公司，陕西杨凌 712100)

苹果茎沟病毒(Applestemgroovingvirus， ASGV)是一种寄主范围广泛的潜隐性病毒，一般不表现出明显的外部症状，但影响嫁接亲和性，造成果实产量和品质下降[1]。ASGV寄主范围广泛，除了苹果外，还侵染梨、柑橘、樱桃、杏等果树和百合等多种寄主[2-4]。ASGV在中国苹果产区发生普遍，调查显示国内主要苹果产区西北高原果区、渤海湾果区、黄河故道果区主栽苹果品种普遍带毒，带毒株率为33.4%～100%[5]。

ASGV是发形病毒属(Capillovirus)的代表种。ASGV粒子为弯曲线状[6-7]，病毒基因组约6.5kb，正义单链RNA。基因组RNA 含有2个开放阅读框(ORF),编码甲基转移酶(Mt)、外壳蛋白(Coat protein,CP)和运动蛋白(Movement protein,MP)等多个蛋白[8-10]。ASGV病毒MP基因与CP基因相对保守,且CP基因的保守性更强[11-13]。

ASGV在栽培品种上不引起明显症状，这对田间病害的识别与诊断带来困难[14-15]。实施苗木脱毒及无毒栽培，可有效控制病害发生蔓延。建立高效灵敏的检测技术，成为解决种苗检疫、抗病性早期鉴定等基本问题的前提，也是果树无毒化栽培的基本保障[16]。因此，对田间样品及脱毒苗木进行病毒检测，是控制病害的重要环节[17-18]。不仅如此，基于血清学技术，对病毒蛋白进行表达分析是研究病毒与寄主互作的重要方法[19-20]。因此，针对ASGV建立血清学检测技术，不仅可以对田间样品和脱毒苗木进行病毒检测，也可以分析病毒蛋白表达。本研究利用原核表达系统获得ASGV的外壳蛋白，并制备多抗血清。利用该蛋白建立针对ASGV的Western blot和DAS-ELISA检测技术。这为病毒的田间样品及脱毒苗木检测、以及病毒蛋白的功能研究提供了技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

ASGV毒源采自陕西杨凌果园，茎尖培养结合热处理获得的脱毒组培苗由陕西果业集团提供。大肠杆菌DH5α、 BL21及表达载体pET-32a由西北农林科技大学植物病毒学实验室保存；PCR 产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、pGEM-T Vector 购自Promega 公司；TaqDNA 聚合酶、逆转录酶、dNTPs、氨苄青霉素、卡纳霉素、 DNA marker、IPTG、X-gal、Trizol 等购自大连宝生物公司(TaKaRa)。其他化学试剂均为国产化学纯。引物根据NCBI数据库已发表基因序列设计，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用于克隆ASGV CP基因的引物序列分别为ASGV-CP1：5′-ATGAGTTTGGAAGACGTGC-3′，ASGV-CP2：5′-CTAACCCTCCAGTTCCAGA-3′。重组表达载体引物为ASGV-CP3： 5′-CG- CGGATCCAGTTTGGAAGACGTGC-3′，ASG- VCP4：5′-CCGGAATTCCTAACCCTCCAGTT- CCA-3′，其中下划线部分分别为EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点。

1.2 方 法

1.2.1 苹果叶片总RNA提取 采集苹果叶片，液氮研磨后采用Trizol试剂盒提取叶片总RNA，具体操作参照说明书。测定核酸OD260/OD280值、结合1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度及完整性。

1.2.2 ASGV cp基因克隆 以苹果叶片总RNA为模板，参照M-MLV逆转录试剂盒说明书合成cDNA第1链。反转录引物为oligod(T)-18。以反转录产物为模板，分别进行PCR扩增。反应条件为：94 ℃变性4 min，94 ℃ 45 s，45 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30 个循环，72 ℃延伸10 min。PCR 产物经纯化试剂盒纯化后与pGEM-T Vector连接，热激法转化到DH5α大肠杆菌中，在LB/Amp/IPTG/X-gal 平板上筛选克隆，挑取阳性克隆送生工生物工程(北京)股份有限公司测序，测序结果采用BLASTn工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行在线比对，采用ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools?clustalw2/index.html)软件进行序列分析。

1.2.3 原核表达载体构建 以获得的含有目标基因的质粒为模板，PCR扩增添加酶切位点，扩增条件同上。PCR产物连接到pGEM-T Vector上，选取测序验证的阳性克隆，经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，与同样酶切处理的pET30a在16 ℃下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α后，挑取克隆并提取质粒酶切鉴定。

1.2.4 重组融合蛋白的诱导条件优化 将酶切鉴定阳性的质粒转化大肠杆菌BL21，鉴定的阳性单克隆37 ℃振荡培养过夜后，按1%接种量接种到新的LB液体培养基(含有100 mg·L-1Kanamycin)中，分别在28 ℃、32 ℃和37 ℃振荡培养至OD600达到0.6 ～ 0.8 时，添加终浓度为0.5 mmol·L-1的IPTG 诱导0 h、2 h、4 h和6 h，分别收集菌体。用适量的细胞裂解缓冲液悬浮菌体，经超声波破碎，12 000 r·min-1离心10 min，分离上清液与沉淀，悬浮沉淀后进行SDS-PAGE 分析。以未诱导培养物为阴性对照。

1.2.5 蛋白纯化与抗体制备 在最适表达条件下诱导表达目的蛋白，收集菌体后经超声波破碎，离心收集的上清通过His-Tag层析柱进行层析纯化，用平衡缓冲液漂洗去除杂蛋白后洗脱目的蛋白。纯化后的目的蛋白委托武汉爱博泰克生物科技有限公司制备抗体。

1.2.6 蛋白免疫印迹分析 提取苹果叶片总蛋白，SDS-PAGE电泳分离后电转移到PVDF膜，封闭后加入适量稀释的抗体，再加入二抗羊抗兔IgG-HRP，进行Western blot 分析。

1.2.7 DAS-ELISA检测 包被缓冲液稀释抗体后加入酶联板，37 ℃孵育2 h。取病叶用PBS缓冲液( pH 6.5) 研磨，离心后取上清滴加至酶联板，4 ℃孵育过夜。加入稀释的酶标抗体37 ℃孵育2 h。加入底物后用酶标仪在405 nm处读取OD值。

2 结果与分析

2.1 ASGV CP基因克隆及表达载体构建

提取苹果叶片总RNA后，采用引物ASGV- CP1/2扩增ASGV CP基因。扩增产物测序结果表明，目标片段为714 bp，预测编码237个氨基酸。所扩增基因与GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中ASGV不同分离物的 CP基因核苷酸同源率为88.80%～91.90%。采用引物ASGV-CP3/4在目标基因两端添加酶切位点EcoRⅠ和BamHⅠ，回收酶切产物并克隆至原核表达载体pET30a(+)。经PCR和测序验证，序列正确的载体命名为pE-ASGV-CP。融合表达的重组蛋白含有6×his标签，用于蛋白 纯化。

2.2 ASGV CP的诱导表达

将pECASGV-CP转化大肠杆菌BL21后诱导表达，SDS-PAGE 分析表明：与阴性对照比较，含有pE-ASGV-CP的BL21经IPTG诱导，在35 ku处出现预期的特异性蛋白表达条带。在37 ℃ 培养条件下，诱导后2 h即出现特异性条带，诱导 4 h和6 h后该条带表达量逐渐略有增加，但变化量不大。在28 ℃、32 ℃ 和37 ℃表达条件下诱导4 h后，各温度条件下均获得目标蛋白的特异性表达，表达量基本一致(图1)。进一步经超声波破碎后分析发现，目标蛋白在各温度条件下均出现在沉淀中，上清液中几乎不可见目标蛋白的表达。表明目标蛋白是以包涵体的形式在细胞中获得表达。洗脱后纯化蛋白主要在目标蛋白洗脱液中，在杂蛋白洗脱液中几乎不可见目标蛋白(图2)。

M.预染蛋白Marker；1、3、5.pE-ASGV-CP分别在28 ℃、 32 ℃和37 ℃的非诱导表达；2、4、6.pE-ASGV-CP分别在28 ℃、32 ℃和37 ℃的IPTG诱导表达

M.Pre-stained protein ladder,1,3,5.BL21 control of pE-ASGV-CP inE.coilat 28 ℃,32 ℃ and 37 ℃; 2,4,6.Induced pE-ASGV-CP expression inE.coilwith IPTG at 28 ℃,32 ℃ and 37 ℃

图1 ASGV CP原核表达分析
Fig.1 Protein expression of ASGV CP inE.coil

M.预染蛋白Marker；1.pE-ASGV-CP非诱导表达；2.pE-ASGV-CP的IPTG诱导表达；3.pE-ASGV-CP诱导表达经超声破碎后上清液；4、5.pE-ASGV-CP诱导表达经超声破碎后沉淀物；6、7、8.非目标蛋白纯化；9.ASGV CP纯化

M.Pre-stained protein ladder;1.BL21 control of pE-ASGV-CP inE.coil；2.IPTG induced pE-ASGV-CP expression inE.coil；3.Supernatant of pE-ASGV-CP protein expression broken by ultrasonic wave;4,5.Precipitation of pE-ASGV-CP protein expression broken by ultrasonic wave; 6,7,8.Elution of non-targeted protein; 9.Elution of ASGV CP

图2 ASGV CP过柱纯化
Fig.2 Protein purification of ASGV CP with column

2.3 抗体制备及检测

纯化的蛋白委托公司制备多克隆抗体。制备的抗体采用ID-ELISA测定效价。将诱导表达的ASGV CP蛋白(500 ng/mL)包被酶联板，采用ELISA法测定抗体效价。当血清稀释度达 12 800后，其P/N值(OD405抗血清/OD405阴性血清)仍大于2.0，这表明所制备的抗体效价达到 1/12 800以上。

以稀释2 000 倍的抗血清作为二抗，提取苹果叶片总蛋白后，采用Western blot进行蛋白杂交分析。结果显示，在预期大小的位置处，所制备抗体能与植物总蛋白发生特异性反应。抗体对目标蛋白结合的特异性较好，背景清晰，且与阴性对照没有特异性反应(图3)。

M.预染蛋白Marker；1、3.ASGV感染苹果样品；2、4.健康苹果样品

M.Pre-stained protein ladder;1,3.Total protein of ASGV infected apple; 2,4.Negative control of healthy apple

图3 ASGV CP抗体Western Blot 分析
Fig.3 Western Blot analysis of ASGV CP

特异性评价：以脱毒组培苗为健康对照，以分别感染ASGV、ASPV和ACLSV的苹果组培苗为材料，研磨提取健康汁液和病汁液包被酶标板，采用DAS-ELISA法测定所制备抗体特异性。分析结果表明，该抗体仅与ASGV样品发生反应，与其他病毒样品及健康对照均无血清学反应。

2.4 苹果样品检测及应用

2.4.1 高通量检测及与RT-PCR方法的比较 取23份经RT-PCR检测为阳性的田间苹果样品，采用制备的抗体通过DAS-ELISA法检测ASGV。检测结果表明其中21份为ASGV阳性。进一步分析2份阴性样品发现，其RT-PCR检测表现为弱阳性。对38份经RT-PCR检测为阳性的带毒组培苗进行DAS-ELISA检测，所有的样品均可检出ASGV。这表明本研究所制备的ASGV抗体可通过DAS-ELISA法用于ASGV的检测，检测结果与RT-PCR法基本一致。

2.4.2 陕西多地苹果样品检测 采用DAS-ELISA法测定陕西主要苹果产区ASGV发生情况。检测结果表明，陕西各主要苹果产区ASGV均普遍发生。其中富县(71.3%)、洛川(75.3%)、宜君(78.9%)、白水(73.8%)、耀州(74.5%)等地的发生率均在70%以上；黄陵(66.7%)、彬州(64.4%)、陇县(62.3%)、千阳(65.7%)、礼泉(63.8%)、扶风(67.5%)、歧山(63.6%)等地 ASGV发生率在60%～70%；低于60%的仅有乾县(59.6%)和富平(58.7%)两个产区。

采用DAS-ELISA法对苹果脱毒苗进行检测，ASGV的带毒率为6.25%。其中，T337的 8株脱毒苗、玉华早富的8株脱毒苗、以及丽噶的8株脱毒面未检出ASGV；富士冠军的8株脱毒苗中，有2株为ASGV阳性。

表1 ID-ELISA测定CP抗血清效价Table 1 Titer determination of prepared antiserum against recombinant CP by ID-ELISA

注：P/N值为OD405(抗血清)/ OD405(阴性血清)。P/N值大于2.0为阳性结果。如果OD405(阴性血清)值小于0.05，则在P/N值计算中取0.05。

Note:P/N is OD405(antiserum)/ OD405( negative serum). The positive result means that P/N value is over 2.0. If the value of OD405( Negative serum) is less than 0.05,0.05 is taken for P/N value calculation.

表2 DAS-ELISA测定抗血清特异性Table 2 Specificity evaluation of prepared antiserum by DAS-ELISA

注：OD405为抗血清值，健康样品的OD405阴性血清值为0.012。

Note:OD405is for antiserum,and OD405for negative control from healthy samples is 0.012.

3 讨 论

基于血清学的病毒蛋白检测是病毒研究的重要工具[21-22]。一方面，在病毒检测中，采用DAS-ELISA等血清学技术可以实现病毒材料的高通量分析，适用于对田间样品和脱毒材料的初筛检测[23-24]；另一方面，病毒蛋白的表达在病毒与寄主互作过程中发挥重要作用，对寄主中病毒蛋白表达的检测需要利用相应抗体[19-20]。

本研究采用原核表达的方法制备ASGV CP蛋白，纯化后制备蛋白抗体。经DAS-ELISA和Western blot分析，所制备的抗体可用于这两种检测方法。在本研究中，采用DAS-ELISA法分别检测陕西苹果主要产区ASGV病毒的发生情况。检测结果表明，ASGV在陕西苹果主要产区严重发生，各产区ASGV发生率在60%以上。基于血清学的DAS-ELISA检测方法具有检测样品制备简单、仪器设备要求较低、低成本和高通量等优势，适合于进行田间样品的大规模检测。病毒脱除是控制苹果病毒病的主要策略和措施[25]。在病毒脱除的各环节中，进行病毒检测以剔除带毒苗是获取无毒苗木的重要内容。本研究采用DAS-ELISA法测定脱毒组培苗的ASGV带毒情况。检测结果发现脱毒苗带毒率较低，且检测结果与RT-PCR法一致。同时，本研究所制备的抗体仅与ASGV发生反应，而与潜隐病毒ASPV和ACLSV不存在血清学反应。在含有ASGV的混合感染样品中，也可以检测到ASGV。不含有ASGV的混合感染样品，则表现为血清学阴性反应。这表明本研究制备的抗体可用于脱毒苗的ASGV病毒检测。

外壳蛋白被认为参与病毒的侵染过程[26-27],CP作为ASGV的结构蛋白，其表达和分布与病毒的侵染与复制密切相关。但是，与 ASGV CP互作的寄主因子目前还不清楚。为此，需要检测病毒侵染过程中CP的表达量变化，并分析其与潜在的寄主因子互作关系。本研究采用Western blot分析苹果叶片中病毒蛋白表达。所制备的抗体与健康叶片总蛋白无血清学反应，而与ASGV感染叶片的总蛋白有特异性条带表现。这表明本研究做制备的抗体可用于检测植物材料中的病毒蛋白表达。