许英民

摘  要： 本试验采取铁力市地区某鹅场鸭疫里默氏杆菌疑似病料进行细菌分离，并对分离细菌进行生化鉴定、PCR鉴定、动物试验和药敏试验。结果表明：分离的2株细菌均为鸭疫里默氏杆菌，分离菌株对头孢氨苄、头孢噻肟、氟苯尼考高敏，对氨苄西林、庆大霉素、链霉素中敏，对环丙沙星、磺胺嘧啶、利福平不敏感。说明头孢氨苄、头孢噻肟可作为此养鹅场防治病的首选药物，其他药物需减少或停止使用。

关键词： 鹅的鸭疫里默氏杆菌;分离鉴定;药敏试验

中图分类号：S858.33     文献标识码：B     文章编号：1673-1085（2020）4-0045-03

鹅的鸭疫里默氏杆菌（Riemerella  anatipestifer，RA）是由鸭传染性浆膜炎引起，是鸭鹅等多种禽类的一种急性或慢性传染病。主要危害3～8周龄的小鸭或小鹅，在临床上表现为困倦、眼鼻有分泌物，绿色下痢，共济失调和抽搐。慢性病例可出现头颈歪斜。病理变化为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、干酪性输卵管炎和脑膜炎，是危害养鹅业最主要传染病之一，如果治疗不及时可引起大批死亡，给养鹅业带来巨大的损失。

在养鹅业的过程中，为了防治细菌性传染病的发生，盲目使用一些抗菌药物，导致环境中RA的耐药性菌株越来越多，表现为多重耐药和交叉耐药，并且不同地区不同饲养场RA的耐药性不同，这就给本病防治带来很多的困难。RA血清型多，达20多个，主要有1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、13、14和其他未知血清，血清型之间无交叉免疫作用，可因血清型不符合导致疫苗免疫失败，因此有必要进行RA的分离鉴定，为鸭疫里默氏杆菌病预防提供一定的指导。

1  材料

1.1  病料来源  铁力市地区发病的养鹅场，无菌采集疑似患有鹅鸭疫里默氏杆菌的病死鹅的心脏、肝脏和脑组织。

1.2  培养基、试剂  普通营养琼脂、麦康凯培养基、TSA、TSB均购自北京奥博星生物技术有限责任公司;生化试剂和药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限责任公司;高保真Taq DNA聚合酶购自北京赛百盛基因技术有限公司，细菌DNAout（G+）购自绵阳高新区天泽基因工程有限公司。

1.3  试验动物  铁力市某养鹅场，10日龄未免疫RA的健康雏鹅15只，常规饲养3d，未发现任何异常，可供动物试验用。

2  方法

2.1  细菌分离  将采集的病料分别划线接种于麦康凯培养基、普通营养培养基、TSA，并将TSA置于CO2培养箱，普通营养培养基和麦康凯培养基置于普通培养箱，37.0℃恒温箱培养24h，选择符合RA特性的菌落，然后涂片、革兰氏染色，镜检，观察结果。并挑取单个菌落反复划线观察，进行分离菌的纯度培养。

2.2  生化鉴定  根据“伯洁细菌鉴定手册”对分离细菌进行常规的生理生化鉴定[1]。

2.3  PCR鉴定  ①引物的设计与合成：根据Genbank中已发表的RA 16s rRNA基因序列，应用Primer5.0软件自行设计合成了一对能扩增1115bp基因片段的引物，序列如下：p1：5′GTA TTC ACC GCG CCA TGG CT3' ;P2：5′TTA GTG AGG TAA CGG CTA AC3';②RA基因组DNA的提取：挑取RA单菌落，接种到5mL TSB中，37.0℃振荡培养过夜，参考细菌DNAout（g+）试剂盒说明书提取全基因组;③PCA体系与反应条件：以提取的RA全基因组为模板，用合成的引物进行PCR扩增，反应条件为：94℃预变性5min;94℃ 1min， 51℃ 1min ，72℃ 1min ，30个循环;72℃ 10min。PCR结束后，取5μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，观察结果。

2.4  动物试验  将2株分离菌株分别接种于TSA上，置于CO2培养箱37.0℃培养48h，将平板上所有菌落刮下，混于灭菌生理盐水中制成细菌悬液，并调整细菌浓度为107CFU/mL。选取15只饲养至13日龄的健康肉鹅雏，随机分为3组，每组5只，试验组每只腿部皮下接种菌液0.5mL，对照组用生理盐水注射。接种后每日观察，记录鹅的精神、食欲、饮水、粪便、运动及死亡情况，并对死亡鹅进行病理剖检，取死亡鹅的心血、肝脏组织进行细菌分离培养。

2.5  药敏试验  参照“兽医微生物学实验指导”[2]中圆纸片扩散法，将2株分离株的菌落分别用灭菌生理盐水洗脱，分别均匀涂布在TSA上，然后将头孢氨苄、头孢噻肟、氟苯尼考、庆大霉素等15种常用抗菌药物的药敏试纸分别贴到平板表面，二氧化碳培养箱37.0℃培养24h，观察抑菌圈的大小并记录结果。

3  结果与分析

3.1  细菌分离[3]  经鉴别培养和涂片、染色、镜检，从采集的病料中分离得到2株疑似RA。细菌在TSA上生长良好，形成光滑、中央隆起、奶油状的圆形菌落，在普通营养琼脂和麦康凯培养基上不生长。在显微镜下观察呈革兰氏阴性、瑞氏染色两极浓染的短杆菌。

3.2  PCR鉴定  以提取的细菌DNA基因组为模板，应用合成的P1和P2为引物进行PCR反应扩增目的基因，所获得的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳呈单一条带，大小与预期1115bp相符。

3.3  动物试验结果  2个试验组的10只小鹅在接种细菌2d后，表现为精神沉郁、食欲减退、眼鼻有分泌物、排黄绿色稀便，死亡之前有头颈震颤、抽搐、共济失调、角弓反张等明显神经症状，分别于接种后2～3d出现死亡，对照组的5只小鹅精神、食欲无异常。病死鹅剖检可见典型的纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎，取脑、心血和肝组织进行细菌分离，其培养特性、生化特性与RA一致。

3.4  药敏试验结果  药敏结果表明，分离菌对头孢氨苄、头孢噻肟、氟苯尼考高敏，对氨苄西林、丁胺卡那、庆大霉素中敏，对环丙沙星、复方新诺明、利福平不敏感。

4  小结与讨论

4.1  在诊断鹅感染鸭疫里默氏杆菌时，要注意与大肠杆菌病相区别，两者在临床症状与剖检变化上极为相似，但在细菌培养特性和生化特性上大不相同。本试验从临床疑似病例中分离得到一株细菌，通过培养特性、形态观察、生化试验进行鉴定，由于RA生化特性存在一定的差异，生化鉴定结果只能初步鉴定为RA，但RA菌株的獲得可为下一步研究该病有效的防治方法奠定基础。

4.2  临床上抗菌药物滥用，导致RA的耐药性在不断地增加，给该病的防治带来很大困难[4，5]。药敏试验结果表明，分离菌株对头孢氨苄、头孢噻肟、氟苯尼考高敏，可为此养鹅场防治该病的首选药物，其他药物须减少或停止使用。

4.3  疫苗免疫是预防鹅的鸭疫里默氏杆菌的有效措施之一，由于RA血清型较多，不同血清型间缺乏交叉免疫力，并且该病可出现多种血清型混合感染及新的血清型不断出现。因此，疫苗免疫效果差。在应用疫苗免疫时，应经常对本地区和本养鹅场的流行菌株进行鉴定，选择同血清型的疫苗或自家苗进行免疫接种，确保免疫效果。

参考文献：

[1]  R.E.布坎南，N.E.吉本斯.伯洁细菌鉴定手册（中国科学院微生物研究《伯洁细菌鉴定手册》翻译组译）[M].北京：科学出版社.1984;385-388.

[2]  姚火春.兽医微生物实验指导（第2版）[M].北京：中国农业出版社，2002：43-44.

[3]  陈溥言.兽医传染病学（第5版）[M].北京：中国农业出版社，2006：400-401.

[4]  陈新浩，陈秋英，诸明涛，等.鸭疫里默氏杆菌病病分离及耐药性调查[J].中国家禽，2010，32（17）50-52.

[5]  傅心亮，嵇辛勤，夏春玲，等.贵州鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析[J].中国畜牧兽医，2013，48（8）155-158.