刘 巍，李婧婧，丁 娅，李丹丹，文习之，祝保艳，张晓实

（中山大学肿瘤防治中心∥华南肿瘤学国家重点实验室∥肿瘤医学协同创新中心，生物治疗中心，广东广州 510060）

PD-1（programmed death factor 1 receptor）抗体在恶性黑色素瘤的疗效数据主要来自白种人群皮肤黑色素瘤临床试验结果。与白种人群不同，中国患者黑色素瘤亚型以肢端和黏膜黑色素瘤为主，而肢端型和黏膜型患者的预后相对较差［1-2］。PD-1 抗体具有起效后长期有效的特点［3］，但其单药有效率仍有限，特别对黑色素瘤的有效率在中国人群较白种人群更低（中国人群二线治疗总体有效率16.7%［4］），起效较缓慢（中位起效时间约3 个月［5］），且部分患者有超进展风险（约9%黑色素瘤患者出现超进展［6］）。目前，以PD-1 抗体等免疫检查点药物为基础的联合治疗策略，成为肿瘤治疗领域研究的一大热点。化疗药物虽已不作为晚期黑色素瘤治疗的一线推荐，但对于短期内迅速遏制肿瘤发展、减轻肿瘤负荷仍具有优势。替莫唑胺还是一种具有免疫调节功能的化疗药物，可发挥促进肿瘤新抗原表达、促进CD8+T 细胞浸润及增强其功能、耗竭和抑制Treg 等免疫效应［7-11］。通过发挥替莫唑胺化疗的抑瘤优势及免疫调节的特点与PD-1 抗体联用，以期提高近期有效率，缩短起效时间，降低超进展风险并达到抑瘤效果长效性的治疗目的。目前国内外尚无PD-1抗体联合替莫唑胺治疗晚期黑色素瘤的临床数据公布。本研究尝试初步探讨PD-1 抗体联合替莫唑胺治疗晚期黑色素瘤的疗效和安全性。

1 材料与方法

1.1 病例资料

2017 年8 月至2019 年4 月在本中心接受“PD-1 抗体＋替莫唑胺”联合方案治疗的晚期黑色素瘤患者，且符合以下入选标准：已经病理学证实为不可手术的局部晚期或转移性黑色素瘤患者；经CT/MRI检查证实有可评价病灶；ECOG评分≤2分；主要器官无功能障碍，实验室检查均符合以下标准：白细胞≥4.0×109/L，中性粒细胞≥1.5×/109/L，血小板≥100 × 109/L，血红蛋白≥95 g/L，血清胆红素≤正常值上限1.5 倍，谷丙转氨酶及谷草转氨酶≤正常值上限2 倍，血清肌酐≤正常值上限1.5 倍。

1.2 治疗方案

患者接受PD-1 抗体＋替莫唑胺联合治疗，替莫唑胺给药：200 mg/（m2·d），连续口服5 d，每28 d为一个周期；或75 mg/（m2·d），连续口服21 d，每28 d 为一个周期。联合用药（PD-1 抗体）包括：Pembrolizumab 2 mg/kg，每3 周为一个周期；或Nivolumab 3 mg/kg，每2 周为一个周期；或Toripalimab 3 mg/kg，每2 周为一个周期。给药疗程：考虑到化疗的毒副反应，联合用药中替莫唑胺化疗达6～8 个疗程后，若患者仍有临床获益，后续方案为PD-1 抗体单药维持治疗。每2 个周期（以替莫唑胺周期为标准，下同）后评价客观疗效。

1.3 疗效及不良反应评价标准

患者治疗前后病灶直径以螺旋CT 或MRI 检查测量，按照美国癌症研究所实体瘤疗效评价标准RECIST v1.1 版进行疗效判定，分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、稳定（SD）和进展（PD），计算客观有效率（objective response rate，ORR）（CR%+PR%）、疾病控制率（disease control rate，DCR）（CR%+PR%+SD%），无进展生存期（progression free survival，PFS）、总生存期（overall survival，OS）、疾病控制时间（duration of disease control，DDC）、缓解持续时间（duration of response，DOR）。PFS 被定义为从联合治疗开始的第1 天到第1 次发生疾病进展或者任何原因死亡的时间。OS 被定义为从联合治疗开始的第1 天到因任何原因死亡的时间。DDC 被定义为从第1 次评估为CR、PR 或SD 到第1 次发生疾病进展或者任何原因死亡的时间。DOR 被定义为从第1 次评估为CR或PR 到第1 次发生疾病进展或者任何原因死亡的时间。不良反应按照NCI-CTCAE 4.0 版毒性评定标准，分为0～5 度。随访截止日期为2020 年2 月5 日。

1.4 统计方法

采用SPSS 25.0 版软件进行统计分析，以Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，组间差异采用logrank 检验。采用COX 比例风险模型进行单因素及多因素生存分析，单因素分析中所有P＜0.1 的变量均纳入多因素分析。P＜0.05（双侧），差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病例特征

2017 年8 月至2019 年4 月共有33 例晚期黑色素瘤患者在我科接受PD-1 抗体＋替莫唑胺联合方案治疗，包括15 例男性，18 例女性。病例特征详见表1。PD-L1 阳性细胞比例大于或等于1%被定义为PD-L1 表达阳性，反之为PD-L1 表达阴性。皮肤型包括慢性阳光损伤型、非慢性阳光损伤型和原发灶不明黑色素瘤。33 例患者接受的中位疗程数为替莫唑胺6.0（1～12）个周期和PD-1抗体7.0（1～27）个周期，有20 例接受了4 个及4 个以上周期（替莫唑胺和PD-1 抗体周期均≥4）的联合治疗。

表1 基线临床病理特征Table 1 Baseline clinicopathological characteristics

2.2 疗 效

入组的33 例患者中，最佳疗效评价结果：无CR的病例，8例为PR（24.2%），12 例为SD（36.4%），13例为PD（39.4%），ORR为24.2%，DCR 为60.6%，见表2。初治患者ORR 为24.0%，复治患者为25.0%，差异无统计学意义（P＞0.05）。从客观有效率来看，总体有效率为24.2%；肢端型黑色素瘤有效率最高，为38.5%；黏膜和皮肤型有效率相差不大，分别为16.7%和15.4%。从疾病控制率来看，总体DCR 为60.6%；肢端和黏膜型黑色素瘤DCR分别为61.5%和66.7%；皮肤型略低，为53.9%。此外，有眼黑色素瘤1 例，疗效评估为SD。但不同组织类型的ORR 和DCR 之间差异均无统计学意义（P＞0.05）。此外，不同年龄（＜60 岁/≥60 岁）、性别、ECGO 评分、LDH 水平（＞/≤正常值上限）、组织来源类型、分期、BARF V600E/K基因突变状态、MGMT基因启动子甲基化状态、肿瘤突变负荷、PD-L1 表达状态等的患者之间ORR 和DCR 亦差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 PD-1 抗体联合替莫唑胺治疗疗效评价Table 2 Response to anti-PD-1 antibody and temozolomide ［n（%）］

2.3 生存期

本研究中患者的中位PFS 为4.3 月（95%CI，1.3～7.3），6 月 和12 月PFS 率 分 别 为37.7% 和17.3%。中位DDC 为7.5 月（95%CI，2.3～12.7），6月和12 月DDC 率分别为51.3%和16.5%。中位DOR 为11.1 月（95%CI，5.5～16.6），6 月 和12 月DOR 率分别为75.0% 和28.1%。中位OS 尚未达到，6 月和12 月OS 率分别为92.7%和86.1%。值得注意的是，肢端型患者mPFS 为4.3 月（95%CI，0.6～7.9），mDDC为6.0月（95%CI，0.9～12.0），mDOR为11.1月（95%CI，3.8～8.4）。肢端型比黏膜型有更久的缓解持续时间（mDOR：11.1vs.2.1，χ2=5.000，P=0.025）。

亚组Kaplan-Meier 生存分析显示，PD-L1 表达阳性患者的PFS 较阴性患者的更长（mPFS：5.2vs.1.7，χ2=4.029，P=0.045；图1A）。BARF V600E/K突变型患者比野生型患者的PFS 更短（mPFS：1.8vs.5.2，χ2=4.631，P=0.031；图1B）。PFS 在初治与复治、不同组织来源类型、不同给药方案以及不同性别、年龄、LDH 等的患者之间差异均无统计学意义（P＞0.05）。COX 回归模型单因素分析显示，P＜0.1 的因素有PD-L1 是否表达和BARF V600E/K是否突变，将其纳入多因素分析，结果显示PD-L1 是否表达和BARF V600E/K是否突变均具有统计学意义（P＜0.05；表3）。

每例患者的缓解深度见图2（包括PR、SD 和PD 患者，有4 例患者数据无法获得），有效患者的缓解持续时间见图3（包括PR 和SD 患者）。图4直观显示了8 例PR 患者中有5 例是肢端型，且缓解时间均超过24 周，其中3 位在在随访结束时仍未出现进展。值得注意的是，其中1 例患者初次评估时为SD，第2 次评估时达PR，之后缓解时间约18 周。

2.4 不良反应

主要不良反应为皮肤瘙痒、皮疹、胃肠道反应以及疲劳，其次为转氨酶升高、白细胞减少以及白癜风。不良反应多为1/2 度，且经对症处理或预防性给药后能好转，其中1 例因2 度白细胞减少持续超过2 周，考虑主要为替莫唑胺副反应，予暂停替莫唑胺化疗并予升白细胞处理后恢复。3/4 度不良反应较少，主要是胃肠道反应（3 度恶心、呕吐）及疲劳，其中1 例患者因出现3 度疲劳，主要在使用替莫唑胺过程中出现，予暂停替莫唑胺化疗后可缓解（表4）。无一例因治疗相关的毒副反应而致死亡。不良反应和近期疗效之间无统计学相关性（P＞0.05）。

图1 生存曲线Fig.1 Survival curve

表3 临床病理特征与PFS 之间的多因素COX 回归分析Table 3 Multivariate(cox-regression)analyses of various clinicopathologic features in melanoma patients

图2 PD-1 抗体联合替莫唑胺治疗的缓解深度（包括SD和PD）Fig.2 The depth of response of anti-PD-1 antibody and temozolomide treatment（SD and PD included）

3 讨论

图3 PD-1 抗体联合替莫唑胺治疗的缓解时间（包括SD）Fig.3 Duration of anti-PD-1 antibody and temozolomide treatment（SD included）

表4 不良反应Table 4 Treatment-related adverse events［n（%）］

国外一项免疫检查点抑制剂ipilimumab 联合替莫唑胺一线治疗转移性黑色素瘤的II 期临床试验取得了不错的疗效（ORR 31.2%，mPFS 5.0个月，mOS 24.5 个月）［13］，这可能与ipilimumab 的高剂量（10 mg/kg）、iRECIST 的评价标准以及一线治疗有关。但国内外均无PD-1 抗体联合替莫唑胺治疗晚期黑色素瘤的临床数据发表。本研究显示，33例晚期黑色素瘤患者接受PD-1 抗体联合替莫唑胺治疗，一线、二线和三线的ORR 分别为24.0%、40.0%和0（初治与复治患者分别为24.0%和25.0%），DCR 分别为64.0%、60.0%和33.3%，总体mPFS 为4.3 个月，mDOR 为11.1 个月。其中二线治疗患者的ORR 为40.0%，DCR 为60.0%，较pembrolizumab单药二线治疗中国晚期黑色素瘤患者的随机Ib期临床试验（KEYNOTE-151，ORR 和DCR 分别为16.7%和38.2%）［4］中的疗效更好。从有效率来看，肢端型ORR 为38.5%，黏膜型ORR 为16.7%，均较pembrolizumab 单药二线治疗中国晚期黑色素瘤患者（KEYNOTE-151，肢端型ORR 15.8%，黏膜型ORR 13.3%）［4］和pembrolizumab/nivolumab 单药治疗韩国转移性黑色素瘤患者（回顾性研究，肢端/黏膜型ORR 为11.5%）［14］的客观有效率更高，尤其是肢端型更为明显。从疾病控制率来看，黏膜型和肢端型DCR 分别为66.7%和61.5%，均明显高于pembrolizumab 在中国晚期黑色素瘤患者（黏膜型20.0%，肢端型42.1%）的疾病控制率［4］。以上不能排除本研究中一线治疗患者居多的影响。我们进一步分析二线治疗患者中的肢端型和黏膜型，可得肢端型ORR 为50.0%（2/4），仍高于PD-1 抗体单药在中国人群中的二线治疗数据（肢端型ORR 15.8%［4］）。我们的研究中二线治疗的黏膜型患者只有1 例，疗效评估为SD，遂未进一步比较。

本研究发现PD-1抗体联合替莫唑胺治疗对肢端型皮肤黑色素瘤有较高的有效率（5/13，38.5%），进一步分析发现，肢端型mDOR 为11.1 个月，5 例PR 患者中有3 例平均随访13.0 个月仍未出现进展，缓解持续时间长。而肢端型中3 例SD 患者的中位疾病控制时间为2.8 个月，显示PR 患者较SD患者疾病控制时间明显增加。但有意思的是5 例PR 患者中有1 例患者第1 次评估时为SD，第2 次评估时达到PR，PFS 为8.87 月，说明SD 患者虽疾病控制时间不长，但有达到PR 的可能，有机会获得更久的疾病控制时间。综上所述，PD-1 抗体联合替莫唑胺治疗晚期黑色素瘤的疗效优于PD-1抗体单药疗效，尤其是对于肢端型效果更佳，值得更进一步的临床研究。

一项替莫唑胺与达卡巴嗪治疗晚期转移性恶性黑色素瘤的随机Ⅲ期临床研究显示：替莫唑胺单药一线治疗晚期黑色素瘤患者ORR 为13.5%，mPFS 为1.9 个月，mOS 为7.7 个月［15］。我们的研究中PD-1 抗体联合替莫唑胺治疗晚期黑色素瘤就总体而言，ORR 为24.2%，mPFS 为4.3 个月，mOS虽未达到，但超过20 个月。进一步分析，PD-1 抗体联合替莫唑胺治疗作为一线治疗时，ORR 为24.0，mPFS 为5.3 个月，mOS＞20 个月，优于替莫唑胺单药一线治疗晚期黑色素瘤患者的疗效。

Kaplan-Meier 法生存分析和COX 多因素分析显示，影响PFS 的因素有PD-L1 表达和BARF V600E/K基因突变状态。PD-L1表达阳性患者比阴性患者有更长的PFS，这与PD-1 抗体单药治疗晚期黑色素瘤PFS 与PD-L1 表达的相关性相符［16］。BARF V600E/K基因突变患者比野生型患者的PFS更短（P＜0.05），可能与BRAF是黑色素瘤的驱动基因［17］有关。本研究中BARF V600E/K突变阳性的两例患者，1 例PD，1 例SD（PFS 为2.7 个月），虽例数少，仍可提示我们PD-1 抗体联合替莫唑胺对BARF V600E/K突变阳性患者疗效可能不佳。

本研究中包含3 例基线合并脑转移的患者，虽例数不多，但均为治疗有效病例，其中2 人PR（1 人已行联合治疗8 程，PD-1 抗体单药维持6 程；另1 人已行联合治疗6 程，PD-1 抗体单药维持21程，均持续中），1 人SD（联合治疗8 程，PD-1 抗体单药维持1 程后肿瘤进展，PFS 为6.1 个月）。我们进一步分析临床资料发现，PR 的两例患者均在联合治疗前进行过脑转移瘤放疗，SD 的1 例患者于联合治疗7 程后行脑转移瘤放疗。黑色素瘤脑转移目前是黑色素瘤免疫治疗中的一大难点，且黑色素瘤极易出现脑转移，替莫唑胺因其可通过血脑屏障的特点，在黑色素瘤脑转移的治疗中具有一定优势。本研究提示PD-1 抗体联合替莫唑胺治疗+脑转移瘤放疗对黑色素瘤脑转移患者的治疗具有一定的临床价值。而关于放疗联合的时机问题，我们的研究提示先行脑转移瘤放疗再行PD-1 抗体联合替莫唑胺治疗对于黑色素瘤脑转移患者的临床获益可能更大。

替莫唑胺的主要不良反应为骨髓抑制和胃肠道反应［15］。PD-1 抗体的毒性谱广泛，涵盖全身各个系统，较为常见的有皮肤毒性、内分泌毒性、肝脏毒性、胃肠毒性、肺毒性等，发生率分别约为30%～50%［18］、10%［19］、2%～10%［20-21］、8%～27%［22］和3.6%［23］。本研究结果与之对比，皮肤毒性发生率相差不大，内分泌毒性发生率更低，肝脏毒性发生率略高，肺毒性未出现，胃肠毒性发生率相差不大，但通常在口服替莫唑胺期间发生，考虑主要为替莫唑胺毒性。且绝大多数为1～2 级，个别3 级不良反应考虑主要为替莫唑胺化疗副反应，停用替莫唑胺可缓解。总体而言，PD-1 抗体联合替莫唑胺方案与PD-1 抗体单药毒性发生率基本相符，未发现增加毒性。

本研究提示PD-1 抗体联合替莫唑胺方案治疗晚期黑色素瘤患者具有优于PD-1 抗体单药和替莫唑胺单药的疗效，可持续的疾病缓解时间和可耐受的毒性反应，且初步观察对肢端型有效率较高且缓解持续时间较长，有望成为晚期黑色素瘤一线或二线以上治疗方案，尤其可推荐于肢端型患者的治疗选择。但由于本研究样本量较小，故PD-1 抗体联合替莫唑胺方案在晚期黑色素瘤治疗中的有效性和安全性仍有待于前瞻性的随机对照临床研究进一步验证。