黄梦瑶，童 昕，蒋 斌

（中山大学中山医学院广东省脑功能与脑疾病研究重点实验室，广东广州 510080）

食欲素（orexin 或hypocetin）是由下丘脑外侧区食欲素神经细胞合成和分泌的兴奋性神经肽，分为Orexin A 和Orexin B（hypocretin-1 and hypocretin-2），主要参与睡眠觉醒、能量代谢、奖赏与药物成瘾等重要生理功能的调节［1-5］。食欲素结合食欲素1 型受体（orexin 1 receptor，OX1R）或食欲素2 型受体（orexin 2 receptor，OX2R）后发挥生物学作用，在大脑皮层中以OX2R 的分布为主［6-8］。而在皮质下，除了蓝斑神经元以OX1R 为主，OX2R 也占较大比例，食欲素与受体相结合后，通过降低钾通道电导、激活钠钙离子交换体和非选择性阳离子通道，提高神经元兴奋性，以及调节突触传递等作用［6］。Orexin 神经元胞体位于下丘脑外侧区，以及穹隆周围核，但其神经纤维广泛的投射至整个大脑皮质区域，包括视皮层［9-11］。在小鼠的初级感觉皮层包括视皮层、体感皮层、运动皮层的第6b 层（layer 6b，L6b）中均发现有一些神经元可以被OX2R 的激动剂所激活产生高频发放的动作电位，称之为Orexin 敏感的神经元［12］。然而皮层L6b 层的细胞种类繁多，根据神经元的形态和电生理特性分为以下5 种类型：锥体神经元（pyramidal neuron）、多极神经元（multipolar spiny neuron）、水平朝向神经元（“horizontally”oriented neuron）、倒置朝向神经元（“inverted”neuron）、以及不定朝向神经元（“tangentially”oriented neuron）［13］。为了明确小鼠视皮层L6b 中的Orexin敏感的神经元的具体细胞类型，我们首先用细胞生物素（biocytin）标记视皮层中L6b 对Orexin 敏感的细胞、外膝体注射逆行标记荧光染料（CTB555）标记L6b 反馈投射到外膝体的神经元，再研究食欲素是否调控这些反馈投射到外膝体的神经元接受第2/3 层的传入的突触传递及其机制。结果表明小鼠视皮层L6b 层中，Orexin B 敏感的神经元主要是锥体神经元和多极神经元。外源Orexin B 受体的激动剂，显著增强反馈投射到外膝体的神经元接受2/3 层的神经传入的突触传递。Orexin B通过增强第2/3 到L6b 锥体细胞的突触传递和直接兴奋L6b 层的锥体神经元两个途径来强化L6b层细胞的活动，加强到外膝体的反馈控制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验所涉及的动物实验获得中山大学实验动物伦理委员会批准［中山医动伦（2018）第156号］，并严格遵循动物伦理要求进行动物实验操作。本实验采用P19-P28 的雌雄C57BL/6J 小鼠（SPF 级，购于中山大学动物实验中心）。分笼饲养，自由摄入水食，室温控制在（22±1）℃，12-12 h昼夜循环光照。实验动物严格遵守《中山大学实验动物管理条例》，实验后，动物尸体按照中山大学实验动物管理办法进行处理。

1.2 脑立体定位注射逆行标记荧光染料CTB555

选择P19-P21 左右的C57 小鼠，称重，按剂量1 mL/20 kg 体质量，腹腔注射0.5%戊巴比妥钠溶液使之麻醉。根据小鼠大脑立体定位图谱确定外侧膝状体（lateral geniculate nucleus，LGN）的坐标，将Bregma 定为零点（0，0，0），Bregma 后2.3 mm，中线左右（2.0～2.1）mm，用颅骨钻打磨颅骨，钻出合适大小的骨窗。注射浓度为2 mg/mL 的CTB555（Cholera Toxin Subunit B，Alexa FluroTM555 Conjugate，Invitrogen，USA）0.2 μL，注射速度控制在0.02 μL/min。为了保证足够的注射量和扩散面积，在相应位置上注射两个点。注射完毕后留针5～10 min。动物苏醒后，正常条件下饲养。整个实验过程中将小鼠置于恒温37 ℃的电热毯上，并涂上眼膏防止小鼠眼睛干燥。

1.3 视皮层脑片制备

选用P22-28 的健康C57BL/6J 小鼠，异氟烷麻醉，快速断头，打开颅骨，取出大脑放入氧饱和的冰冷切片液中，1 min 后转移至预冷的装有冰冷切片液的平板中修块，去除小脑组织，切下大脑枕叶，以横断面为底座用瞬间粘合胶固定到振动切片机平台上，随后立即倒入冰冷切片液浸没脑组织，通以体积分数95%O2和5%的CO2混合气体。调整切片机速度为3，振幅7～8，将脑组织切成8～10 片300 μm 厚度的含有视皮层的冠状脑片，后随即转移至氧饱和的人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF）中，34 ℃孵育30 min，后转移至室温使用。

1.4 脑片上记录细胞的自发兴奋性突触后电位

用装有电流钳内液的玻璃电极（内含0.2%Biocytin，Sigma，USA），电流钳方式钳住皮层第6b层（L6b）中的神经细胞，记录L6b 中各种细胞上的自发兴奋性突触后电位（spontaneous excitatory postsynaptic potential，sEPSP；图1、2）。待细胞稳定下来后（约3 min），置换成含有100 nmol/L Orexin B（Tocris Bioscience，UK）的ACSF（其中含有兴奋性和抑制性突触受体的阻断剂），给药灌流3 min 后，再用普通ACSF 进行洗脱，观察被记录的细胞是否能被Orexin B 的激动剂所兴奋。本实验通过PClamp 软件可以实现封接电阻，串联电阻和输入电阻的读取，并在实验全程对串联电阻进行实时监控，对于串联电阻前后变化不超过20%的数据才进行统计分析。

1.5 标记L6b 神经细胞类型

细胞载入Biocytin 后（至少持续记录sEPSP 5 min），缓慢移出电极，保持细胞活性状态，即刻将脑片转移至40 g/L 多聚甲醛溶液中固定，避光保存于4 ℃冰箱。24 h 后，取出脑片盛放在12 孔板的小孔里，用0.01 mol/L PBS 溶液漂洗3～5 次。再将脑片放入体积分数0.3% Triton-100 的PBS 中2 h。按1∶200 稀释度加入Avidin 555（Streptavidin，Alexa Fluro 555 conjugate，Invitrogen corporation，USA），混匀后，用锡纸包裹，放置4℃冰箱过夜。后再用0.01 mol/L PBS 溶液漂洗，双光子显微镜扫描拍照，观察细胞的形态（图1、2）。

1.6 自发兴奋性突触后电流和微小兴奋性突触后电流的记录

外膝体注射CTB555 一周后的小鼠，异氟烷使之麻醉，断头，制作视皮层脑切片。电压钳模式下，钳住经CTB555 标记的、反馈投射到外膝体的L6b 中的神经元（图3），将膜电位钳制于-70 mv，记录细胞的自发兴奋性突触后电流（spontaneous excitatory post synaptic current，sEPSC；图4A），先用普通的ACSF 记录3 min，然后换成含有100 nmol/L Orexin B（Tocris Bioscience，UK）的ACSF（其中含有兴奋性和抑制性突触受体的阻断剂），给药灌流3 min 后，再用普通ACSF 进行洗脱。观察外源Orexin B 给药后，由LGN 逆行标记的视皮层L6b 细胞是否产生内向电流。

微小兴奋性突触后电流（miniature excitatory post synaptic current，mEPSC）与sEPSC 一样，只是在灌流液ASCF 中分别加入Tetrodotoxin（TTX，1 μmol/L）、Picrotoxin（50 μmol/L）、CNQX（20 μmol/L）以及APV（100 μmol/L）阻断所有突触传递（图4C）。通过比较Orexin B 加药前后的振幅和频率，判断Orexin B 对Orexin B 敏感神经元的作用是突触前作用还是突触后作用。

1.7 Evoked EPSC（eEPSC）的记录

外膝体CTB555 注射一周后的小鼠，异氟烷使之麻醉，断头，制作视皮层脑切片。电压钳模式下，钳住被经CTB555 标记的、反馈投射到外膝体的L6b 中的神经元，将电极尖端直径为125 μmol/L的双极同心圆电极放置于视皮层的第5 层（L5），刺激来自L2/3 的传入到该细胞的神经传入，记录由电刺激L2/3 引起的AMPAR-EPSC（图5、6）。实验通过PClamp 软件可以实现封接电阻，串联电阻和输入电阻的读取，并在实验全程对串联电阻进行实时监控，对于串联电阻前后变化不超过20%的数据才进行统计分析。

1.8 数据的统计与分析

本实验所以的电生理数据均由PClamp 软件记录并分析处理，mEPSC 数据由Minianalysis software 软件分析，最后用GraphPad software 对数据进行t检验或方差分析。

2 结果

2.1 Orexin B 直接兴奋小鼠视皮层第6b 层中的神经元

为了探究小鼠视皮层L6b 中的神经元细胞类型以及是否存在对Orexin B 敏感的神经元，我们在P19-P28 C57BL/6J 小鼠视皮层离体脑片上，在电流钳模式下，用含有0.2% biocytin 的记录电极随机钳住细胞，记录神经元的兴奋性突触后电位（sEPSP）。由于哺乳动物神经元的静息电位离阈电位之间有一定的差值，因此我们通过改变灌流液ACSF 中的K+浓度，适当降低神经元的膜电位水平使细胞的膜电位接近阈电位水平。观察Orexin B 灌流给药3 min 后，记录电位的变化。为了减少药物干扰，所有实验每个脑片只记录一个细胞，实验结束后立即将脑片转移至40 g/L 的多聚甲醛中固定，后续通过免疫染色后，在双光子显微镜下对细胞进行形态分析。结果显示，小鼠视皮层L6b 中细胞的形态主要有锥体神经元、多极神经元、水平朝向神经元、倒置朝向神经元、以及不定朝向神经元（图1 A、D 和图2A、D、G），结果与文献报道的一致［13］。分析每种细胞对应的电生理数据（图1B、E 和图2B、E、H）发现，小鼠视皮层中确实存在Orexin B 敏感的神经元（图1B、E）。通过外源激活Orexin B 受体可以直接对Orexin B敏感细胞产生兴奋性调节效应。其中大部分锥体细胞（58.1%）和多极细胞（52.9%；图1 C、F）为Orexin B 敏感的神经元。在Orexin B（100 nmol/L）作用3 min 后，细胞膜发生去极化并伴有成串的动作电位，且随着正常的ACSF 洗脱，动作电位的频率降低。然而水平朝向神经元、不定朝向神经元和倒置朝向神经元在Orexin B（100 nmol/L）作用前后膜电位水平无明显变化（图2B、E、H）。说明水平朝向神经元、不定朝向神经元和倒置朝向神经元为Orexin B 不敏感神经元。

图1 Orexin B 直接兴奋小鼠视皮层第6b 层中的锥体神经元和多极神经元Fig.1 Orexin B directly excited the pyramidal neuron and multipolar spiny neuron in layer 6b of visual cortex

图2 小鼠视皮层第6b 层中水平朝向神经元、不定朝向神经元和倒置朝向神经元为食欲素不敏感神经元Fig.2 Horizontally oriented neurons，inverted neurons and tangentially oriented neurons were Orexin B-insensitive neurons in layer 6b of visual cortex

2.2 逆行标记荧光染料CTB555标记视皮层第6b层中的神经元

视皮层L6b 同时接收来自第2/3 层纤维自上而下的传入，同时也接受来自外膝体纤维自下而上的传入。因此视皮层中L6b 也是一个重要的输出层，反馈投射到LGN 以及其它间脑核团。为了标记视皮层第6b 中的神经元，我们在小鼠两侧的LGN 中注射逆行病毒标记物CTB555（图3A），7～10 d 后切脑片在双光子显微镜下观察病毒标记情况。结果（图3B）所示，病毒染料CTB555 成功标记了视皮层L6b 中的神经元，即第6b 层中反馈投射至LGN 的神经元。

2.3 Orexin B 增大视皮层第6b 层中投射到外侧膝状体的神经细胞的兴奋性突触后电流的振幅

为了研究Orexin B 对视皮层L6b 层中投射至LGN 的神经元的兴奋性突触后电流（sEPSC）的作用，我们在电压钳模式下，采用全细胞记录模式，记录被CTB555 标记的红色荧光细胞的sEPSC（图4），在被CTB555标记的红色荧光细胞上，直接激活Orexin B受体可以记录到去极化电流（图4A）。为了研究Orexin B 的浓度与去极化电流之间的关系。采用10、20、50、100 和200 nmol/L 进行浓度梯度灌流，相关系数为0.7168，P=0.0212，发现两者之间为正相关关系，且100 nmol/L时引起的去极化电流已达到最大值［10 nmol/L：（24.78±2.03）pA，n=13 cells，8 mice；20 nmol/L：（53.12±2.24）pA，n=13 cells，6 mice；50 nmol/L：（74.56±2.66）pA，n=17 cells，8 mice；100 nmol/L：（79.5±2.41）pA，n=12 cells，7 mice；200 nmol/L：（83.56±2.36）pA，n=12 cells，7 mice；图4B；F=99.69，P＜0.000 1］。

图3 标记小鼠视皮层第6b 层中投射至外侧膝状体的神经元Fig.3 Neurons in L6b of visual cortex projecting to the dorsal lateral geniculate nucleus labeled by CTB555

为了进一步研究Orexin B 引起的去极化效应是源于突触前还是突触后，我们在ACSF 中分别加入Tetrodotoxin（TTX，1 μmol/L），Picrotoxin（50 μmol/L）、CNQX（20 μmol/L）以及APV（100 μmol/L）阻断所有突触传递并记录微小兴奋性突触后电流（mEPSC），将细胞钳制于-70 mv，稳定记录3～5 min，后切换含Orexin B 的灌流液，记录5～8 min，用mini-analaysis 分析统计mEPSC 的振幅和频率（图4C）。发现Orexin B 增加了mEPSC 的振幅［Ctr：（9.36±0.034）pA，Orexin B：（11.51±0.036）pAn=19 cell from 7 mice，pairedt-test，P=0.03］但其频率没有变化［Ctr：（1.48±0.08）Hz，Orexin B：（1.55±0.09）Hz，n=19 cell from 7 mice，pairedt-test，P=0.67］，该结果说明Orexin 增强突触传递是通过突触后效应（图4D）。

2.4 Orexin B 增强视皮层第6b 层中投射到LGN的神经细胞接受第2/3 层神经传入的突触传递

为了探究Orexin B 是否调节L6b 的Orexin B敏感神经元接受第2/3 神经传入的突触传递，用金属电极刺激来自第2/3 的神经传入，电压钳钳住L6b 中被CTB555 标记的荧光细胞，记录兴奋性突触后电流（eEPSC）。将细胞膜电阻变化前后不超过10%，系列电阻变化不超过15%的记录细胞数据纳入分析（图5A）。Orexin B 加入后，EPSC 逐渐增大，到药物开始洗脱时EPSC 达到最大值，随着洗脱减小，最后趋于平缓（图5A、C）。EPSCs的记录为每15 s 给予一对刺激，刺激时间间隔为0.1 s（图5A），通过对配对脉冲比率（paired-pulse ratio，PPR）的值（PPR=P2/P1，P1 和P2 分别为第1个刺激和第2 个刺激诱发EPSC 的振幅大小）。

Orexin B 加药之前PPR 为1.21±0.05，加药后PPR 为1.17±0.05（n=20 cells，pairedt-test，P=0.64；图5B），加药前后PPR 无显著变化，因此Orexin B 对L6b 中其敏感神经元上来自第2/3 层的输入纤维突触传递的增强作用是突触后效应。为了探究Orexin B 对L6b 层中来自2/3 层传入纤维的突触传递的增强是否也存在剂量依赖性效应，我们分别用不同浓度的Orexin B 20、50 和100 nmol/L 的Orexin B 重复上述实验。发现Orexin B浓度越大，加药后突触后电流（EPSC）增大越明显［加入Orexin B并洗脱后20～25 min，100 nmol/L：（130±2.5）%，n=19 cells，8 mice；50 nmol/L：（117±2.7）%，n=10 cells，5 mice；20 nmol/L：（105±1.8）%，n=9 cells，5 mice；图5D，F=19.86，P＜0.000 1］。

图4 Oreixn B 在视皮层第6b 层中投射至LGN 的Orexin B 敏感神经元的sEPSC 和mEPSC 的效应Fig.4 The effects of Orexin B on the sEPSC and mEPSC in Orexin-sensitive neurons in layer 6b of visual cortex

图5 Orexin B 增强视皮层L6b 层中Orexin 敏感神经元上接受第2/3 层神经传入通路的突触传递Fig.5 Orexin B enhanced the synaptic transmission onto Orexin B-sensitive neurons in layer 6b from layer 2/3 input

2.5 Orexin B 的突触传递增强效应由ORX2 介导，mGluR5 的参与，并激活PLC 引起胞内Ca2+上调而产生

为探索Orexin B 增强第2/3 层传递到Orexin B敏感神经元的突触传递的具体机制，我们首先加入OX2R 受体的阻断剂TCS OX2R 29（10 μmol/L），发现增强现象被阻断［加入Orexin B 并洗脱后20～25 min，（Ctr：（119.33±2.51）%，n=15 cells，7 mice；TCS OX229：（103.17±2.75）%，n=30 cells，10 mice）；图6A；unpairedt-test，P=0.000）］。为了研究OX2R 受体激活后引起的细胞内分子机理，我们加入磷脂酶C（phospholipases C，PLC）的阻断剂U173332 后，Orexin B 的增强作用也被阻断［Ctr：（125.51±1.4）%，n=11 cells，5 mice；U173332：（103.89±1.04）%，n=10 cells，5 mice；图6B，unpairedt-test，P=0.000］，表明OX2R 受体激活后，导致细胞内的PLC 活性上调。在电极内液中加入BAPTA（胞内Ca2+的螯合剂10 mmol/L），细胞破膜形成全细胞模式5 min 后开始记录，以使BAPTA 扩散进入细胞。在BAPTA 存在的情况下，Orexin B 的增强效应也完全被阻断［Ctr：（125.54±1.53）%，n=11 cells，5 mice；BAPTA：（102.86±1.7）%，n=9 cells，4 mice；图6C；unpairedt-test，P=0.000）］。因此，Orexin B 的增强作用需要胞内Ca2+水平升高。加入受体mGluR5 的拮抗剂，MPEP（10 μmol/L），Orexin B 的增强效应也被阻断［Ctr：（126.14±3.87）%，12 cells，5 mice；MPEP：（106.32±2.65）%，n=12 cells，6 mice，unpairedttest，P=0.000］，表明Orexin B 调控第2/3 层传入到L6b 中的orexin 敏感神经元的突触增强效应是由ORX2 介导，mGluR5 的参与，并激活PLC 引起胞内Ca2+上调而引起。

图6 Orexin B 增强食欲素敏感神经元接受第2/3 层神经传入的突触传递的机制Fig.6 The mechanisms of Orexin B to enhance synaptic transmission onto Orexin B-sensitive neurons from layer2/3 inputs

3 讨论

大脑皮层由6层组成，各层中呈现出不同的神经细胞类型以及不同的神经连接。作为多形细胞层的第6 层又分为位于浅部的第6a 层（L6a）和深部临近白质（white matter，WM）的6b 层（L6b）［14-16］。尽管有报道［12］发现视皮层L6b 亚层中的一些细胞对Orexin 敏感，即激活Orexin B 可以直接兴奋L6b中的一些神经元。但没有明确具体的神经细胞类型。本研究发现Orexin B 能直接兴奋第6 层中的大部分的锥体神经元和多极神经元，但Orexin B不直接兴奋L6b 中的水平朝向神经元，倒置朝向神经元和不定朝向神经元。我们还发现在L6b 中由CTB555 标记的、反馈投射到外膝体的神经元92.5%为锥体神经元，且这些锥体神经元中有63.3%对Orexin 敏感［17］，因此，Orexin B 除了直接兴奋由外膝体逆行标记的锥体神经元和多极神经元外，还增强第2/3 层传入到位于L6b 中由CTB 555 标记的，反馈投射到外膝体的锥体神经元之间的突触传递。

探索L6b 中Orexin 敏感细胞的形态和神经连接以及Orexin 在视皮层内部突触传递中的效应对理解Orexin 在视觉处理中的作用至关重要。视觉信号由视网膜传送到丘脑的外膝体，信号经处理后主要传递到视皮层第4 层，少量传至到第2/3 层以及第5/6 层［18-19］，而视皮层的第6 层也将接受视皮层第2/3 层的信号反馈传递给丘脑背侧外膝体（dLGN）和丘脑侧后核群（LP），从而形成重要的反馈环路［20-21］。第6 层到外膝体的反馈环路在视觉信息的筛选和精练中起重要作用。第6 层细胞的活动加强，即加强了L6b 细胞到外膝体的反馈控制可以锐化LGN 的视觉信息并传到第4 层，因此，第6 层细胞是外膝体信息传入的监控器，放大或减弱LGN 到视皮层的信息输入［22］。研究结果提示：Orexin B 通过增强第2/3 到第6 层锥体细胞的突触传递和直接兴奋第6 层的锥体神经元两个途径来强化第6 层细胞的活动，加强到外膝体的反馈控制。由于Orexin 的主要作用是维持动物的觉醒状态［1-2］，据此推测动物在清醒的状态，投射到视皮层的Orexin 系统激活后强化第6 层细胞的活动，可使动物在清醒、警觉的状态下更为有效地对视觉信息有效的筛选，增强视皮层对视觉信息的分辨率。

食欲素直接兴奋大脑中的某些神经元，特别是在感觉皮层的机制已有详细的报道［12］，Orexin使神经元产生缓慢而持久的去极化，这种变化足以使神经元爆发动作电位，若神经元已经爆发动作电位，Orexin 则可以提高其放电频率。概括起来，Orexin 对神经元的去极化可归因于三个机制：①在静息电位时关闭钾离子通道［23］；②Na+/Ca2+交换器的激活［24-25］；③非选择性阳离子通道（NSCCS）的激活［26-27］。我们的结果表明在视皮层，Orexin B 选择性地作用于L6b 中的锥体神经元。Orexin B 增加了mEPSC 的振幅，但频率却不受影响，表明Orexin B 对L6b 中的锥体神经元的作用是通过直接的突触后作用。第6 层锥体细胞膜上的OX2R 在Orexin B 的激活下发挥作用。

尽管已有研究表明初级视皮层第6b 是对Orexin有反应的唯一亚层［12］。然而Orexin B参与对第6b层其敏感的神经元接受的传入纤维的突触传递的调控至今未见报道。本文研究了Orexin B 调节小鼠视皮层L6b 层锥体神经元接受来自L2/3 信息传入的突触传递的效应以及生理学机制，发现Orexin B 增强L6b 的锥体神经元接受第2/3 层传入纤维的突触传递，这种突触增强效应由ORX2 介导，mGluR5 的参与，并激活PLC 引起胞内Ca2+上调而引起。在视觉信息传递过程中，通过接收L2/3的前馈传入，从而增强第6b 锥体细胞的兴奋性。