陈宏伟，姜 云，郭雪峰，张秀萍*

（1. 塔里木大学 动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300；2. 新疆生产建设兵团第二师畜牧兽医工作站，新疆 铁门关 841000）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是奶牛乳房炎最主要的病原菌。它所引起的奶牛乳房炎占所有细菌性乳房炎的30%～50%[1]。细菌性乳腺炎导致奶牛生产性能下降，牛奶品质不佳，严重威胁人类健康。临床上多采用抗生素方法治疗奶牛乳房炎，随着抗生素的使用，耐药性菌株大量出现，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）流行株的逐年增多，常导致奶牛乳房炎慢性和复发性感染，使临床治疗更加困难。奶牛养殖业是新疆地区重要的产业之一，目前新疆流行的临床型奶牛乳房炎MRSA 优势序列型主要是ST188、ST9、 ST63、 ST2700、 ST968、 ST2373、 ST398、ST2393、t034、t189，多重耐药率高，而且从牛乳中分离到人源性ST188，ST9[2-3]，这说明MRSA 可在不同的宿主物种之间传播、进化、感染。因此，寻找绿色安全的控制策略具有重要的公共卫生意义。

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）具有防治奶牛乳房炎的功效。S.aureus 能黏附、内吞到乳腺上皮细胞，借助各种表面蛋白和毒力因子侵入乳腺组织内部定植并增殖，刺激炎症应答反应。LAB 抑制乳房炎性S.aureus 的机理主要有两种机制：一种是黏附、竞争和内吞抑制机制，另一种是炎症免疫抑制机制[4]。LAB 防治奶牛乳房炎已经取得了一定的临床效果，而且从乳与乳制品中分离出的LAB 治疗乳房炎更具有其独特的同源性优势。

新疆不同牧区鲜牛乳和哈萨克族传统乳制品酸奶疙瘩中蕴含丰富的LAB 资源[5]，从中开发高效、稳定、安全的天然抗病原菌株对防治本地常发病奶牛乳房炎和生产优质牛奶具有极大的研究和应用价值。因此，本研究以前期工作中分离到的奶牛乳房炎源S.aureus N2作为指示菌，从新疆巴音布鲁克牧区乳品原料中筛选对其具有抗菌作用的LAB，为研发LAB 生物防控制剂提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 从新疆和静县巴音布鲁克牧区无菌采集新鲜牛乳4 份，传统发酵成品酸奶疙瘩4 份，加冰袋放入保温箱迅速带回实验室。以前期研究分离到的奶牛乳房炎S.aureus N2作为抑菌检测指示菌，该分离株具有广泛的耐药性，对苯唑西林高度敏感，具有较强的生物被膜（BF）形成能力，携带7 个BF 形成相关基因（icaA、icaD、icaR、sigB、sarA、rbf、sasG）和4 种肠毒素基因sea、sec、seg、sei，由兵团南疆环塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室保存[6]。

MRS 培养基、TSA 培养基、TSB 培养基、Nisin A 标准品（效价1×106IU/g）和透析袋MD34（3500）均购自青岛海博生物技术有限公司；2×Easy Tap PCR SuperMix、DL2000 DNA Marker 和琼脂糖均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 LAB 的分离纯化及抑菌能力的检测 样品以10 倍梯度连续稀释，取10-4、10-5、10-63 个梯度稀释液涂布于MRS 固体培养基上，于5%CO237 ℃培养48 h。观察记录菌落形态特征，在MRS 平板上划线分离纯化。将纯化后革兰染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌落接种至MRS 斜面。采用双层琼脂扩散法进行分离株抑菌能力的检测[7]：将50 ℃左右TSB软琼脂倒入灭菌平皿，冷却后放置3 个牛津杯，倾倒含有S.aureus N2的TSB 软琼脂，在牛津杯孔中加入分离株培养液，于37 ℃培养24 h，用游标卡尺测定抑菌圈直径。对分离菌进行菌体形态观察。

1.3 LAB 16S rDNA 基因测序 选取有抑菌能力的分离株接种于MRS 液体培养基培养24 h，提取基因组DNA，利用细菌通用引物27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGTCAG-3'和1492R：5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'，PCR 扩 增16S rDNA 基 因 片 段。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将测序菌株16S rDNA基因序列与NCBI 中已知序列进行同源性比对，确定测序菌株的属种。

1.4 LAB 生长曲线和产酸曲线的测定 利用待测LAB 24 h 的培养液，以3%的接种量接入MRS 液体培养基，于5%CO237 ℃恒温培养36 h。每隔2 h测定培养液OD600nm值和pH 值，每次测定3 个重复，取平均值，分别以OD600nm平均值和pH 平均值为纵坐标，以时间为横坐标，绘制菌株生长曲线及产酸曲线。

1.5 LAB 细菌素提取与效价检测

1.5.1 LAB 细菌素的提取 将培养20 h 的菌株培养液4 ℃离心取上清液，加入等量饱和度60%硫酸铵溶液，4 ℃搅拌过夜，离心，沉淀用3.5 ku 透析袋透析24 h。然后4 ℃离心，收集沉淀，真空冷冻干燥。1.5.2 LAB 细菌素的效价检测 准确称取0.1 g Nisin 标准品溶于1 mL 0.02 mol/L 的稀盐酸中，得到效价为105IU/mL 的标准液。采用浓度为0.02 mol/L 的稀盐酸进行2 倍稀释，使得溶液的终浓度分别达到5×104IU/mL、2.5×104IU/mL、1.25×104IU/mL、6.25×103IU/mL、3 125 IU/mL、1 562.5 IU/mL，按双层琼脂扩散法测定抑菌活性，各浓度梯度设3 个重复，以平均抑菌圈直径为纵坐标，对应的效价对数值为横坐标，绘制Nisin 效价标准曲线。

细菌素冻干粉用PBS（pH 7.0）缓冲液溶解配制成浓度为10 mg/mL 的使用液，检测其抑菌活性，细菌素测定液设3 个重复，将抑菌圈直径平均值代入标准曲线公式，计算LAB 粗细菌素效价。

2 结 果

2.1 LAB 的分离及抑菌活性的检测 本次研究从新疆和静县巴音布鲁克牧区采集的4 份鲜乳，4 份传统酸奶疙瘩中分离到18 株细菌，经双层琼脂扩散法筛选到5 株对指示菌S. aureus 具有明显抑制作用的LAB，观察对应菌体形态显示有革兰阳性杆菌2株，球菌3 株（图1）。

图1 5 株分离菌的抑菌试验结果及菌体形态特征(革兰染色100×10）Fig.1 Inhibitory effects and morphological characteristics of five isolates

2.2 LAB 16S rDNA 基因测序 利用细菌通用引物对所提取的5 株分离株的16S rDNA 基因组进行PCR扩增，均获得约1 500 bp 片段（图2）。PCR 扩增产物经测序后进行分析比对，结果显示分离株与希氏乳杆菌（Lactobacillus hilgardii）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）及乳酸乳球菌亚种（Lactococcus lactis subsp.）各自同源性均为100%。表明本次分离到的5 株LAB 为希氏乳杆菌、干酪乳杆菌、粪肠球菌、戊糖片球菌及乳酸乳球菌亚种。

2.3 LAB 生长曲线和产酸曲线的测定 通过分光光度计法测得5 株LAB 的生长曲线，呈现了快、中、慢3 种趋势：希氏乳杆菌生长曲线高于其它4种，表明该菌增殖速度较快数量多；干酪乳杆菌、粪肠球菌和乳酸乳球菌3 种细菌增殖能力相当，戊糖片球菌生长曲线低于其它4 种菌，表明该菌增殖速度较慢（图3）。

5 株LAB pH 值变化规律显示培养液接种2 h 左右开始产酸，pH 值由6.0 降到5.5 左右，培养15 h 后pH 值降到5.0 以下，保持在3.8～5.0。希氏乳杆菌、干酪乳杆菌的曲线在底端，表明它们产酸速率快、产酸能力强（图4）。

图2 5 株分离菌的16S rDNA 基因组PCR 扩增结果Fig.2 Results of 16S rDNA gene PCR amplicons of five isolates

图3 5 个分离株生长曲线的测定结果Fig.3 Growth curves of five isolates

图4 5 个 分 离 株36 h 内pH 变 化Fig.4 Dynamic change of pH value of the five isolates in 36 hours

综合以上结果显示，5 株LAB 的生长规律和产酸规律存在对应关系：0～2 h 为停滞期，菌体浓度无明显增加，pH 有微小幅度下降（0.2～0.5）；2 h 后进入对数生长期，菌体生长代谢旺盛，产生大量有机酸，pH 迅速下降；20 h 左右达到生长稳定期，菌体浓度逐渐趋于稳定，pH 也逐步趋于稳定；30 h 后进入衰亡期，pH 有微幅上升，但低于4.8。生长曲线和产酸趋势表明分离到的5 株LAB 的生长速率和产酸速率呈正相关关系。

2.4 LAB 细菌素提取与效价检测 对5 株LAB 培养20 h 培养液离心后采用饱和度60%硫酸铵溶液盐析，提取到分子量在3.5 ku 内的粗细菌素，其平均抑菌圈直径分别为：25.0 mm、27.0 mm、26.0 mm、28.5 mm和27.0 mm。通过制作Nisin 效价标准曲线，获得回归方程：Y=5.7619X-9.6762，R2=0.992，经计算5株LAB的粗提物的效价分别为：希氏乳杆菌457 IU/mL，干酪乳杆菌1 023 IU/mL，粪肠球菌676 IU/mL，戊糖片球菌1 862 IU/mL，乳酸乳球菌1 023 IU/mL。抑菌结果表明5株LAB的粗细菌素具有抑菌作用。

3 讨 论

虽然国内外已有用于防治牛乳房炎的LAB 制剂，但效果明显的产品种类很少，而且对LAB 与病原菌的相关性，LAB 与宿主机体之间的互作机理研究尚处于初级阶段。本研究从新疆草原地区新鲜牛乳及发酵乳品中分离到的5 株LAB，活菌和提取物细菌素均有稳定的抑菌特性，表明分离株符合筛选目标。益生菌可以提高畜禽机体免疫力，生产实践中直接给畜禽饲喂LAB 制剂，可以调节肠道微生态环境，改善肠道黏膜免疫系统状态。有研究报道干酪乳杆菌、乳酸乳球菌亚种、戊糖片球菌和粪肠球菌属于应用效果好的菌种之列[8]，与本实验分离菌种一致。

产酸能力是LAB 发挥抑制病原作用的重要因素之一。本次分离到的5 株LAB 的生长速率和产酸速率呈正相关，培养15 h 后pH 值降到5.0 以下，之后保持在3.8～5.0，根据细菌素的分泌规律，即一般都是在细菌的对数生长期中期开始合成并分泌，且随着细菌数量的增多而增加分泌，直到生长平台期的早期达到分泌的最高峰，本次研究在20 h 时对培养液进行提取细菌素，此时活菌数量最多，推测产生的代谢产物生物活性效果应该最佳。通过提取细菌素检测抑菌效果，结果5 株LAB 均具有良好的抑菌活性，这与其他研究者认为LAB 在培养液pH 4.0～5.0 时具有抑菌能力，但当pH≥5 时对部分致病菌无抑菌性的试验结论相一致，表明分离株抑菌活性作用的发挥要在一定的酸性范围。

本次分离株戊糖片球菌虽然生长缓慢，产酸能力较弱，但是粗提细菌素的效价最高，这可能与戊糖片球菌和S.aureus 的近缘性有关。分离株希氏乳杆菌的生长性能和产酸性能均较强，但与其他4 种LAB 相比，希氏乳杆菌粗提细菌素的效价最低，说明希氏乳杆菌的代谢抑菌物质可能存在其他机酸产物，或者饱和度60% 硫酸铵溶液盐析不是最佳提取条件。希氏乳杆菌是一种厌氧菌，对营养要求不高，常致发酵食品和酒精饮料腐败，但是近年研究发现它能抑制黄曲霉的生长和黄曲霉毒素B1（AFB1）的产生[9]，对革兰阴性杆菌如成团肠杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌亚种有抑制作用，但对革兰阳性菌没有抑制作用[10]。本次分离株希氏乳杆菌增殖和产酸速率快，国内首次证明对S.aureus 有抑制作用。

筛选拮抗奶牛乳房炎病原菌的菌株应具备以下特性：能黏附到乳腺上皮细胞（bMEC）、定殖、形成生物膜、疏水性、自凝集性、产生抗菌代谢产物等。目前一些干酪乳杆菌分离株和乳酸乳球菌亚种分离株被证明具有显著的抑制S.aureus 粘附、侵入bMEC 的能力，如CI2、BL23、CIRM-BIA 667，CRL 1655，LMG 7930，V7，DPC 3251 等[11-16]。龚虹，Espeche 等认为戊糖片球菌疏水性、自凝集性和生物膜的形成能力均较弱，不适合作候选菌株[17-18]。粪肠球菌也被认为是奶牛乳房炎的致病菌之一，但生成生物膜能力强，对bMEC 黏附能力强[19]，有希望通过基因工程改造为有益菌。因此，后续研究将检测分离株对bMEC 的黏附能力。

从新疆巴音布鲁克牧区鲜乳和酸奶疙瘩中筛选到5 株LAB 即希氏乳杆菌、干酪乳杆菌、粪肠球菌、戊糖片球菌和乳酸乳球菌，分离株通过在低酸环境下产生细菌素发挥抑制S.aureus 生长的作用。