孟文俊，苏艺华

(1.沧州职业技术学院 基础部，河北 沧州 061000；2.沧州师范学院 继续教育学院，河北 沧州 061000)

茴香为伞形科茴香属多年生草本植物，具有强烈的香气，原产于地中海沿岸及西亚，现主要集中产于欧亚大陆。在我国，茴香已有上千年的栽培历史，广泛分布于东北、华北和西北地区[1,2]。茴香种子及其挥发油是重要的调味品，在全世界范围内广泛使用。此外，茴香挥发油也能药用，具有抗菌消炎及镇痛的功效[3,4]。茴香挥发油是无色或淡黄色液体，具有独特的香味，主要成分是茴香脑和葑酮，以及少量的柠檬烯、蒎烯、γ-松油烯等萜烯类成分[5,6]。现有的茴香挥发油的提取方法主要有水蒸气蒸馏法、蒸馏萃取法、微波辅助法和亚临界流体萃取法等[7-10]。近年来，酶预处理成为挥发油提取过程中的常用辅助方法，酶预处理可以破坏植物细胞壁，促进细胞活性成分溶出，提高得油率[11]。本文利用纤维素酶预处理后蒸馏提取茴香挥发油，在单因素试验的基础上，采用L9(34)正交试验优选最佳工艺，并分析了酶预处理后提取的茴香挥发油的成分。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

茴香：试验用茴香产自河北；纤维素酶：产于河北拓海生物科技有限公司，活力单位10000 U/g；柠檬酸、石油醚、无水硫酸钠：均为分析纯。

1.1.2 仪器

HH-S型恒温水浴锅 巩义市英峪予华仪器有限公司；QP2010气相色谱-质谱联用仪 Shmadzu公司；AB135-S分析天平 Mettler-Toledo公司；RE-52A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 挥发油的提取

将茴香籽粉末50 g置于100 mL烧瓶中，根据试验设计的需要，加入适量纤维素酶溶液，在一定的温度和pH条件下预处理一定时间。随后，利用水蒸气蒸馏法提取茴香挥发油，蒸馏液以石油醚萃取，加入无水硫酸钠，静置，干燥脱水，再使用减压旋蒸法去除石油醚，得到茴香挥发油。为了对比，不经过酶预处理，利用相同方法提取茴香挥发油。称重，计算茴香挥发油的得油率。

1.2.2 单因素试验

设定纤维素酶的添加量为0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，预处理温度为50 ℃，调节pH值为5，预处理时间为4 h，随后参照1.2.1中的蒸馏法提取茴香挥发油，并计算得油率；设定纤维素酶的添加量为1.5%，分别设定预处理温度为40，45，50，55，60，65 ℃，调节pH值为5，预处理时间为4 h，随后参照1.2.1中的蒸馏法提取茴香挥发油，并计算得油率；设定纤维素酶的添加量为1.5%，预处理温度为50 ℃，分别调节pH值为3.5，4，4.5，5，5.5，6，预处理时间为4 h，随后参照1.2.1中的蒸馏法提取茴香挥发油，并计算得油率；设定纤维素酶添加量为1.5%，预处理温度50 ℃，调节pH值为5，分别预处理1，2，3，4，5，6 h，随后参照1.2.1中的蒸馏法提取茴香挥发油，并计算得油率。

1.2.3 正交试验

根据单因素试验结果，以茴香挥发油的得油率为考察指标，选取纤维素酶添加量(1%、1.5%、2%)、预处理温度(45，50，55 ℃)、预处理pH值(4.5，5，5.5)、预处理时间(3，4，5 h)4个因素设计L9(34)正交试验。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 纤维素酶添加量对挥发油得油率的影响

茴香挥发油得油率与纤维素酶添加量的关系见图1。

图1 茴香挥发油得油率与纤维素酶添加量的关系Fig.1 The relation between the yield of fennel volatile oils and the additive amount of cellulase

由图1可知，未添加纤维素酶时，挥发油的得油率最低，随着纤维素酶添加量的增加，挥发油得油率快速增加，但当纤维素酶的添加量超过1.5%时，进一步增加纤维素酶添加量，挥发油得油率增加缓慢，甚至不再变化。这是由于茴香籽与纤维素酶已经结合，继续增加纤维素酶的添加量，已经没有多余的底物能够与其结合，挥发油提取率几乎不再改变[12]。

2.1.2 纤维素酶预处理温度对挥发油得油率的影响

茴香挥发油得油率与预处理温度的关系见图2。

图2 茴香挥发油得油率与酶预处理温度的关系Fig.2 The relation between the yield of fennel volatile oils and the enzyme pretreatment temperature

由图2可知，随着酶预处理温度的升高，茴香挥发油的得油率明显增加，但当温度超过50 ℃时，继续升高酶预处理温度，挥发油的得油率反而下降，这是由于温度过高时，纤维素酶的活性降低，从而导致茴香挥发油的得油率降低。

2.1.3 纤维素酶预处理pH值对挥发油得油率的影响

茴香挥发油得油率与酶预处理pH值的关系见图3。

图3 茴香挥发油得油率与酶预处理pH值的关系Fig.3 The relation between the yield of fennel volatile oils and the enzyme pretreatment pH value

由图3可知，随着pH值的增加，茴香挥发油的得油率明显上升，当酶预处理pH值达到5时，茴香挥发油的得油率最高，进一步增加pH值，得油率明显下降，这种变化趋势可能与纤维素酶的最佳pH值有关，pH值过高或过低都会影响纤维素酶的活性[13]。

2.1.4 纤维素酶预处理时间对挥发油得油率的影响

茴香挥发油得油率与酶预处理时间的关系见图4。

图4 茴香挥发油得油率与酶预处理时间的关系Fig.4 The relation between the yield of fennel volatile oils and the enzyme pretreatment time

由图4可知，随着酶预处理时间的增加，茴香挥发油的得油率明显增加，当预处理时间超过4 h时，进一步增加预处理时间，挥发油的得油率几乎不再变化[14]。

2.2 正交试验结果

根据单因素试验的结果，对影响茴香挥发油得油率的主要影响因素：纤维素酶添加量、酶预处理温度、酶预处理pH值和酶预处理时间，采用正交试验对酶预处理条件进行优化。因素水平设计见表1，正交试验结果见表2。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交试验方案与结果Table 2 Orthogonal experimental scheme and results

由表2可知，各因素对茴香挥发油得油率的影响大小依次为A>B>C>D，即纤维素酶添加量对茴香挥发油得油率的影响最大，其次为酶预处理温度、酶预处理pH值，酶预处理时间对得油率的影响最小。在选定的水平中，各因素的最优水平为A2B2C2D3，即纤维素酶添加量为1.5%，酶预处理温度为50 ℃，酶预处理pH值为5，酶预处理时间为5 h。试验验证结果表明，在最优提取条件下，茴香挥发油的得油率可达1.69%，高于正交试验的所有结果。

2.3 不同预处理方法对茴香挥发油得油率的比较

不同预处理方法对茴香挥发油得油率的比较见表3。

表3 茴香挥发油得油率与预处理方法的关系Table 3 The relation between the yield of fennel volatile oils and the pretreatment methods

由表3可知，对纤维素酶预处理最佳提取工艺组合进行预处理，茴香挥发油得油率最高，达到1.68%，高于不添加纤维素酶和不做预处理的提取方式。

2.4 不同预处理方法对茴香挥发油成分的影响

不同预处理方法的茴香挥发油主要成分见表4。

表4 茴香挥发油的主要成分表Table 4 The main components of volatile oils of fennel %

纤维素酶预处理对茴香挥发油成分的影响较大，反式-茴香脑和含氧化合物的比例均高于未做预处理的茴香挥发油，香味更加明显。总的来说，经过酶预处理后的茴香挥发油具有更好的品质[15]。

2.5 不同预处理方式下细胞壁的形貌表征

不同预处理方式后细胞壁的SEM图片见图5。

图5 不同预处理方式后细胞壁的SEM图片Fig.5 The SEM figures of cell walls with different pretreatment methods

注：a表示未经预处理；b表示温水浸泡预处理；c表示纤维素酶预处理。

由图5a和图5b可知，不经过任何预处理或温水浸泡预处理后的茴香籽的细胞壁表面由多层保护结构覆盖，细胞壁难以被破坏或仅只有物理上的破坏，在较长的蒸馏时间下，体内的精油无法被顺利提取，挥发油得油率仍然较低。由图5c可知，纤维素酶预处理后，由于酶解的作用，细胞壁被破坏，体内精油更容易被提取，挥发油得油率增加。

3 结论

利用纤维素酶预处理结合蒸馏法提取茴香挥发油，并利用正交试验探讨了最佳提取工艺。结果表明：纤维素酶添加量1.5%，预处理温度50 ℃，预处理pH值5，预处理时间5 h时，茴香挥发油的得油率最高，达到1.68%，明显高于温水浸泡处理后蒸馏和直接蒸馏法。纤维素酶预处理后提取的挥发油的反式-茴香脑和含氧化合物比例更高，具有更好的品质。纤维素酶预处理能够破坏茴香籽的细胞壁，使茴香挥发油更容易被提取。