于沛，王修俊*，商景天，冯廷萃

(1.贵州大学发酵工程与生物制药省级重点实验室，贵阳 550025；2.贵州大学 酿酒与食品工程学院， 贵阳 550025；3镇远县名城食品厂，贵州 镇远 557700)

泡菜是将新鲜蔬菜利用中低浓度食盐水进行泡渍腌制，通过前期微生物(乳酸菌为主)发酵、后期调味加工制成的产品[1]。乳酸菌是一类能够发酵碳水化合物且产乳酸的革兰氏阳性细菌的统称[2]。

亚硝酸盐(nitrite，NIT)的安全控制一直是泡菜发酵过程中的关键问题之一，亚硝酸盐能使血红蛋白氧化为高铁血红蛋白，导致低氧血症[3]；亚硝酸盐在人体内会积累转变为亚硝胺，可导致胃癌、甲状腺癌等[4,5]。自然发酵的泡菜存在着发酵周期长、亚硝酸盐含量不可控等问题[6]。许多研究表明乳酸菌在泡菜发酵过程中有降解亚硝酸盐的作用[7,8]，降解机理为乳酸菌可产酸和产亚硝酸盐还原酶[9]。故生产上常采用直投式乳酸菌发酵，使亚硝酸盐含量可控，继而有许多具有优良性能的乳酸菌菌株被筛选鉴定[10]。本实验室前期就从自然发酵泡菜中筛选出一株有高效降解亚硝酸盐功能的优势菌株LP-7501S，现以萝卜作为原料，利用LP-7501S进行强化发酵，以蔗糖添加量、食盐添加量、氮源添加量、发酵时间和发酵温度进行单因素试验与正交试验，研究LP-7501S降解亚硝酸盐的最佳发酵工艺，为泡菜发酵过程中亚硝酸盐降解及控制提供更有效的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

试验原料：萝卜，贵阳市花溪区吉林村农贸市场。

试验试剂：食用盐，四川省南充顺城盐化有限责任公司；蔗糖，太古糖业(中国)有限公司；酵母抽提物(生化试剂)；亚铁氰化钾；乙酸锌；冰乙酸；硼酸钠；盐酸；对氨基苯磺酸；盐酸萘乙二胺。

1.1.2 试验仪器

电热鼓风恒温干燥箱 上海贺德试验设备有限公司；恒温恒湿培养箱 上海博迅实业有限公司；722型分光光度计 上海佑科仪表仪器有限公司；酸度计 上海理达仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程

1.2.2 发酵萝卜中NIT降解工艺的单因素试验

1.2.2.1 自然发酵萝卜中总酸和NIT含量变化测定

选取外观饱满、无破损的新鲜萝卜，洗净、沥干后切成1.5 cm3大小的正方体，装坛，加入含4%食盐和0.7%蔗糖的发酵液(发酵液∶萝卜为1.5∶1)，用10%盐水水封后于30 ℃下发酵9 d，每隔1 d取样，根据GB/T 12456-2008中pH电位法和GB 5009.33-2016中盐酸萘乙二胺分光光度计比色法测定样品中总酸与NIT含量[11，12]。

1.2.2.2 糖类添加量对总酸和NIT的影响

选用0.4%、0.7%、1.0%、1.3%、1.6% 5个浓度梯度来进行研究，试验其余条件一致：4%食盐，0.7%氮源，发酵液中LP-7501S接种量106CFU/mL，30 ℃发酵6 d，每隔1 d取样测定总酸与NIT含量。

1.2.2.3 食盐添加量对总酸和NIT的影响

以传统自然发酵萝卜中的食盐添加量为参考指标，对3%、4%、5%、6%、7% 5个食盐浓度梯度进行研究，试验其余条件一致：0.7%糖，0.7%氮源，发酵液中LP-7501S接种量106CFU/mL，30 ℃发酵6 d，每隔1 d取样测定总酸与NIT含量。

1.2.2.4 氮源添加量对总酸和NIT的影响

因萝卜的组成成分中蛋白质的含量仅为1.2 mg/g左右[13]，所以氮源的添加量直接影响LP-7501S的生长繁殖，从而影响泡菜中的总酸和NIT含量。以萝卜中蛋白质的含量为参考依据，试验分别对0.4%、0.7%、1.0%、1.3%、1.6% 5个氮源添加量进行研究，其余发酵条件为：4%食盐，0.7%糖，发酵液中LP-7501S接种量106CFU/mL，30 ℃发酵6 d，每隔1 d取样测定总酸与NIT含量。

1.2.2.5 发酵时间对总酸和NIT的影响

腌制天数的长短对泡菜的软脆度及风味变化有所影响，腌制过久，口感会稍差或变得不佳[14]。以食盐添加量为4%，糖类添加量为0.7%，氮源添加量为0.7%，发酵液中LP-7501S接种量为106CFU/mL，于30 ℃下对萝卜发酵6 d，每隔1 d取样测定总酸与NIT含量。

1.2.2.6 发酵温度对总酸和NIT的影响

试验分别以20，26，30，33，37，40 ℃ 6个温度梯度进行研究，其余发酵条件一致：4%食盐，0.7%糖，0.7%氮源，发酵液中LP-7501S接种量106CFU/mL，发酵6 d，每隔1 d取样测定总酸与NIT含量。

1.2.3 发酵萝卜中NIT降解工艺的正交试验设计[15]

以单因素试验为基础，选取蔗糖浓度(A)、食盐浓度(B)、氮源添加量(C)、发酵时间(D)、发酵温度(E)5个因素按L16(45)正交表进行正交试验，以NIT含量和总酸为指标研究LP-7501S发酵萝卜的最佳因素，研究不同因素对发酵萝卜中NIT和总酸含量的影响，试验因素水平表见表1。使用SPSS软件进行数据分析确定NIT降解的最佳发酵工艺。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 试验结果与分析

2.1 自然发酵萝卜中总酸和NIT含量变化

图1 自然发酵过程中总酸含量变化Fig.1 The change of total acid content in natural fermentation process

由图1可知，9 d内发酵萝卜中总酸含量随发酵时间先上升而后趋于稳定的趋势，原因可能是乳酸菌等在发酵初期生长代谢产较多酸导致总酸含量上升，而5 d之后发酵体系中总酸含量偏高，使乳酸菌生长代谢产酸受到抑制，总酸含量趋于稳定。

图2 自然发酵萝卜NIT含量变化Fig.2 The change of nitrite content in naturally fermented radish

由图2可知，在3 d内样品中NIT含量随发酵时间的延长而逐渐增大，NIT含量于3 d时达到最高值14.20 mg/kg；3 d后因泡菜中乳酸菌群的生长繁殖、代谢产酸和产酶，导致NIT被降解，结合图1可知，6 d后因样品中的总酸含量趋于稳定，NIT的酸降解途径受到抑制，同时总酸含量偏高抑制了亚硝酸盐还原酶的酶活性，使NIT含量趋于稳定。

2.2 糖添加量对总酸和NIT含量的影响

糖添加量对发酵萝卜总酸和NIT含量的影响结果见图3和图4。

由图3可知，各组在发酵3 d内因LP-7501S的生长代谢产酸，故总酸含量呈上升趋势；3 d时，总酸含量升高使LP-7501S生长代谢受到抑制，所以总酸含量趋于稳定。根据糖添加量的不同，在1 d内各组产酸差别较大，而到2 d后产酸差别较小。原因可能为LP-7501S在有较多糖的条件下能迅速代谢产生较多的有机酸。

图3 糖添加量对总酸含量的影响Fig.3 The effect of sucrose additive amount on total acid content

图4 糖添加量对NIT含量的影响Fig.4 The effect of sucrose additive amount on nitrite content

由图4可知，在1 d内各组泡菜中NIT含量均迅速增加，结合总酸产量可得出在发酵初期，LP-7501S产酸总量相对较少，泡菜中的总酸含量低，不能抑制部分杂菌的生长代谢，导致萝卜中硝酸盐被还原，引起NIT含量升高，之后LP-7501S大量生长成为优势菌株，产生大量有机酸和亚硝酸盐还原酶，使大量NIT被降解。之后因为总酸含量较高，导致泡萝卜中的其他杂菌生长和酶活同时受到抑制，最终使NIT含量趋于稳定。

结合图3和图4可知，糖添加量对LP-7501S代谢产酸和降解NIT影响较小，但是糖类的添加会影响泡菜发酵口感和风味。因此，结合表2中感官评价，从NIT、总酸、感官和经济效益角度考虑，选用蔗糖作为实际发酵的添加糖类，最佳添加量为0.7%左右。

表2 不同糖添加量发酵萝卜感官评价Table 2 The sensory evaluation criteria of fermented radish with different sugar additive amount

2.3 食盐添加量对总酸和NIT含量的影响

食盐浓度对发酵萝卜总酸和NIT含量的影响结果见图5和图6。

图5 食盐添加量对总酸含量的影响Fig.5 The effect of salt additive amount on total acid content

图6 食盐添加量对NIT含量的影响Fig.6 The effect of salt additive amount on nitrite content

由图5可知，在泡菜发酵过程中，发酵体系内食盐含量越高，总酸产量越低。由图6可知，发酵体系内食盐含量越高，对LP-7501S降解NIT能力的抑制作用越强，原因为高盐浓度会抑制LP-7501S产酸和亚硝酸盐还原酶的酶活性，导致NIT降解缓慢，同时有一些耐盐杂菌会大量繁殖，可能会使NIT产生量增多。发酵2 d后，食盐添加量为3%、4%和5%的泡菜中的NIT含量都在1.0 mg/kg以下，结合表3中感官评价，选择食盐添加量为4%左右。

表3 不同食盐添加量发酵萝卜感官评价Table 3 The sensory evaluation criteria of fermented radish with different salt additive amount

2.4 氮源添加量对总酸和NIT含量的影响

氮源对发酵萝卜总酸和NIT含量的影响结果见图7和图8。

图7 氮源添加量对总酸含量的影响Fig.7 The effect of nitrogen source additive amount on total acid content

由图7可知，在3 d内，氮源添加量越大，产酸速度越快，总酸含量增加越迅速。

图8 氮源添加量对NIT含量的影响Fig.8 The effect of nitrogen source additive amount on nitrite content

由图8可知，氮源添加量越多，NIT降解速度越快，原因可能是大量的氮源能使LP-7501S在短时间内迅速生长繁殖，成为优势菌株，产生大量有机酸。但氮源过多会导致两大不利因素：一是发酵速度过快，产酸过多导致泡萝卜酸味重，影响萝卜结构，同时氮源本身会影响泡萝卜风味；二是氮源添加量过多会在发酵后期LP-7501S生长受抑制时导致某些杂菌大量生长，结合表4的感官评价，综合考虑，选择碳源的添加量为0.7%左右。

表4 不同氮源添加量发酵萝卜感官评价Table 4 The sensory evaluation criteria of fermented radish with different nitrogen source additive amount

2.5 发酵时间对总酸和NIT含量的影响

发酵时间对发酵萝卜总酸和NIT含量的影响结果见图9。

图9 发酵时间对总酸和亚硝酸盐含量的影响Fig.9 The effect of fermentation time on total acid and nitrite content

由图9可知，1～3 d内，样品内总酸含量上升较快，NIT降解迅速，说明LP-7501S在此阶段生长繁殖迅速，代谢产酸、产酶量较高；3 d以后，总酸含量趋于稳定，NIT含量也基本趋于稳定，说明LP-7501S的生长受到酸度的抑制作用。因此，综合考虑，选择发酵时间为3～4 d。

2.6 发酵温度对总酸和NIT含量的影响

发酵温度对发酵萝卜总酸和NIT含量的影响结果见图10和图11。

图10 发酵温度对总酸含量的影响Fig.10 The effect of fermentation temperature on total acid content

图11 发酵温度对NIT含量的影响Fig.11 The effect of fermentation temperature on nitrite content

由图10可知，在30 ℃和33 ℃的发酵体系中总酸含量增加较快，故LP-7501S在泡菜中的适宜代谢产酸温度应该为30～33 ℃，而由图11可知，NIT的峰值和终值均在30～33 ℃条件下较低，分析原因可能是LP-7501S在30～33 ℃时生长繁殖迅速，在发酵体系中能迅速成为优势菌群，同时结合图10可知，LP-7501S在30～33 ℃条件下产酸速率最快，使生成的NIT迅速降解，同时较高的酸度抑制部分能产生NIT的杂菌生长代谢，阻断了NIT生成。但泡菜发酵过程中，过高的温度可能会引起一些丁酸细菌大量繁殖，产生氨等一些不良的风味物质，使泡菜成品的品质下降，故综合考虑，以30 ℃作为LP-7501S接种发酵的最佳温度。

2.7 发酵萝卜中NIT降解工艺正交试验优化结果

通过对蔗糖浓度(A)、食盐浓度(B)、氮源添加量(C)、发酵时间(D)和发酵温度(E)进行单因素试验后，采用L16(45)正交表，以总酸和NIT含量为指标研究5个因素协同作用下LP-7501S在发酵体系中产酸和降解NIT的最优工艺。正交试验优化结果见表5。

表5 正交试验优化结果Table 5 The optimized results of orthogonal test

由表5中极差R1可知，5个因素中影响总酸含量的主次为发酵时间(D)>发酵温度(E)>氮源添加量(C)>蔗糖浓度(A)>食盐浓度(B)，最优的产酸工艺为A3B3C4D4E4。根据方差分析得出发酵时间对总酸影响显著(p<0.05)。

由极差R2可知，上述5个因素中影响NIT含量的主次为发酵温度(E)=发酵时间(D)>氮源添加量(C)>蔗糖浓度(A)>食盐浓度(B)，最优的NIT降解工艺为A4B2C3D4E3，通过SPSS软件对各因素进行方差分析，得出发酵温度和发酵时间对NIT含量影响显著(p<0.05)。

综合产总酸和NIT含量的最优方案，A3B3C4D4E4组合的发酵温度较高、产酸量过高，可能会影响成品风味。故选择A4B2C3D4E3组合作为LP-7501S发酵萝卜产酸和降解的最优工艺，即0.9%蔗糖、4%食盐、0.7%酵母抽提物、30 ℃发酵84 h，因正交表中没有出现这项组合，因此按A4B2C3D4E3进行3次平行试验，测定总酸、NIT含量与感官评价，试验结果见表6。

表6 试验验证结果Table 6 The result of verification test

由表6可知，在A4B2C3D4E3的降解工艺条件下，测得发酵萝卜中总酸含量为0.73 g/100 g，NIT含量为0.432 mg/kg，感官评价为75分。

3 结论

试验得出最优发酵工艺：蔗糖添加量为0.7%，食盐添加量为4%，氮源添加量为0.7%，发酵时间为84 h，发酵温度为30 ℃。在此发酵工艺条件下，总酸含量为0.73 g/100 g，发酵体系中亚硝酸盐快速降解，含量可降至更低的水平0.432 mg/kg。得出相比自然发酵，用LP-7501S进行强化发酵，并采用最佳发酵工艺，可显著降低亚硝酸盐的含量，而且可明显提高泡菜发酵过程中亚硝酸盐的降解速度。此工艺条件下所得到的泡菜在保证口感脆嫩酸甜、香气醇正的同时，具有更高的安全性。