（佛山职业技术学院，广东佛山528137）

通过酶法水解能够改善蛋白质的多种功能性质，但酶法水解会导致蛋白质分子量显著降低，影响蛋白质的乳化性，不利于水解蛋白的广泛应用。近几年，国内外将研究重点放在美拉德反应初期糖基化改性上。美拉德反应初期生成的产物因拥有良好的功能性质而受到广泛的关注。糖基化改性蛋白质的功能特性是基于美拉德反应生成蛋白质与糖的衍生物，是一种绿色、自发的反应，具有较高的安全性。糖分子能够与蛋白质共价结合，显著改善蛋白质的功能性质[1]。糖分子不仅能够改善蛋白质由于分子量过小引起的乳化性问题，增加了水解蛋白扩散到油水界面上的速率[2]。此外，能够有效保护蛋白水解物原有的抗氧化效果。张欣等[3]将豌豆蛋白水解物分别与葡萄糖、麦芽糊精和葡聚糖进行温和的美拉德反应显著改善了原有的乳化活性，并保留了抗氧化性。其中，葡聚糖还能够改善蛋白质的空间结构，起到增稠的作用。但是，美拉德反应处于中后期时容易引起蛋白质交联，破坏其乳化性[4-5]。为了能够让美拉德反应处在糖基化反应阶段，所以要控制反应过程[6]。通过研究糖分子与水解蛋白的交联，提升水解蛋白的乳化性能的作用机理。

苦荞蛋白由于其较高的营养价值和生理功能受到广泛关注。苦荞蛋白不仅具有抗氧化、预防心血管疾病、降血脂、降血糖、降血压等功效，还能够减肥败毒、清理人体垃圾、激活胰岛素分泌。因此，本研究采用碱性蛋白酶水解1 h的苦荞蛋白与3种还原糖（葡萄糖、麦芽糊精、葡聚糖）进行交联，优化美拉德反应的条件。通过测定游离氨基含量、乳化活性、乳化稳定性以及乳状液的粒径、电势和，比对3种还原糖与苦荞蛋白水解物反应生成共聚物的乳化性能的变化情况以及对苦荞蛋白水解物抗氧化能力的影响，为高效、安全的生产乳化剂奠定了理论基础，在乳化型食品的生产加工方面具有较好的理论和现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料

苦荞麦：吉林省松原市北显粮油贸易发展有限公司；葡萄糖、麦芽糊精、十二烷基硫酸钠（SDS）、2，4，6-三硝基苯磺酸：美国Sigma公司；葡聚糖：美国Spectrum公司；碱性蛋白酶：丹麦Novo公司；三氯乙酸、硫代巴比妥酸：美国Fisher公司。

1.2 仪器与设备

DH-9070A型电热恒温鼓风干燥箱、DK-8B型电热恒温水浴锅：上海精宏设备有限公司；JB-2型恒温磁力搅拌器：上海雷磁新径仪器有限公司；ER型冷冻离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；TU-1800型紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 苦荞蛋白提取

将苦荞麦粉碎以料液比1∶10（体积比）、pH 8.0、温度40℃，搅拌提取1 h后6 000 r/min离心分离20 min，取上清液用1 mol/L HCl调pH值至4.5，水洗沉淀后用1 mol/L NaOH调pH值至中性，冻干备用。

1.3.2 苦荞蛋白水解物的制备

参照Wang等[7]的方法，苦荞蛋白的底物浓度为4%（质量比），碱性蛋白酶在pH 8.0，55℃条件下水解1 h，酶与底物比为 2∶100（质量比），使用1 mol/L的NaOH维持pH值不变。水解后95℃水浴加热5 min，用1 mol/L HCl将pH调成中性后在9 000 r/min下离心10 min并将上清液用分子量为100 Da的透析袋进行透析12 h除去盐后冷冻干燥，并在4℃下保存。

1.3.3 美拉德反应共聚物的制备及反应条件的确定

参照Zhu等[8]的方法。水解苦荞蛋白分别与葡萄糖、麦芽糊精和葡聚糖混合于磷酸盐缓冲液中（50 mmol/L，pH 7.0）中。反应条件：反应温度为70℃，蛋白浓度为2%，糖浓度分别为5%、7.5%、10%，pH值分别为 6.5、7.0、7.5，反应时间分别为 6、8、12、24 h。相同条件处理TBPH（不含糖）做为对照组。反应完成后立即放入冰水中冷却并且4℃保存。

1.3.4 褐变程度的测定

根据Ajandouz等[9]的方法并作恰当修改。样品稀释20倍后在420 nm处进行比色。

1.3.5 游离氨基含量测定

取200 μL样品加入到2 mL 0.1%SDS中混匀，加入1 mL 0.01%2，4，6-三硝基苯磺酸溶液，避光处理，50℃水浴保温60 min后加入2 mL 0.1 mol/L Na2SO3进行终止反应，室温下放置15 min，在420 nm处进行比色。以2 mmol/L亮氨酸做标准曲线，确定水解液中游离氨基含量[10]。

1.3.6 乳化活力及乳化稳定性的测定

参照Li等[11]的方法。取1mg/mL的水解样品8mL，加入2 mL的大豆油，13 500 r/min下乳化1 min。在乳化0 min和10 min后，分别取50 μL乳状液加入装有5 mL 0.1%SDS溶液的离心管中，混匀后在500 nm处进行比色，计算公式如下：

式中：A0为初始乳状液的吸光值；A10为乳状液静置10 min后的吸光值；c为样品溶液的蛋白浓度（g/mL）；φ为乳状液中油相的比例；n为稀释倍数。

1.3.7 乳状液电势和粒径的测定

将10%（质量比）的大豆油与90%（质量比）含不同乳化剂的水溶液混合（Tween 20为乳化剂作为对照组），13 500 r/min下乳化2 min后，35 MPa下经高压均质机均质两次。加入叠代钠（0.03%，质量体积比）进行抑菌。取均质后的乳状液50 μL，加入到装有5 mL超纯水中混匀，注入到弯曲毛细管中，在常温下使用Malvern激光粒度仪测定不同样品的ζ-电势和粒径。

1.3.8 抑制脂质体氧化能力

根据Decker和Hultin[12]的方法稍作修改。0.2 mg/mL大豆卵磷脂溶解在0.12 mol KCl中，5 mmol/L组氨酸缓冲溶液（pH 6.8）均质后，在4℃进行超声降解45 min。5 mL脂质体和1 mL样品测定抗氧化活性，1 mL超纯水作阴性对照，0.02%BHA作为阳性对照。在脂质/蛋白溶液（6 mL）中分别加入0.1 mL 50 mmol/L的FeCl3和10 mmol/L的抗坏血酸盐。样品在37℃水浴中保温60 min，加入2 mL 2.8%FeCl3溶液和1 mL 1%硫代巴比妥酸溶液，沸水加热15 min，冷却室温后，加入等量的氯仿。在532 nm处进行比色。计算公式如下：

TBARS/（mg/L）=（A532/Vs）×9.48

式中：A532为溶液在532 nm的吸光值；Vs为待测样品的体积，mL；9.48为常数。

1.4 统计分析

每个试验重复3次，结果表示为平均值±标准差。数据统计分析采用Statistix 8.1（分析软件，St Paul，MN）软件包中Linear Models程序进行，差异显著性（P<0.05）分析使用Tukey HSD程序，采用Sigmaplot 11.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 美拉德糖基化反应条件的确定

图1为通过测定不同pH值、反应时间下TBPH与葡聚糖美拉德反应产物褐变程度来评价美拉德反应的进程，最终确定反应条件为pH 7.0、反应浓度为10%、反应时间为12 h。

图1 不同反应条件下苦荞蛋白水解物与葡聚糖美拉德反应产物的褐变程度Fig.1 The extent of browning in the Maillard conjugation of TBPH and dextran under different conditions

为了有效提高蛋白质功能特性，可以引入糖分子与蛋白质的美拉德反应，但是美拉德反应在中后期时蛋白质的乳化性能逐渐丧失[13]。然而，在美拉德反应中反应初期得到的产物较为温和，若将美拉德反应控制在初级阶段不仅不会减弱功能性质，还能够增加蛋白质的乳化性能[14]。美拉德反应受到多种因素的影响，反应温度、反应时间、反应物的浓度和pH值条件都会通过影响蛋白质的聚集和焦糖化反应进程而影响产物的褐变程度。当反应时间为24 h褐变程度过高时，说明反应已向着美拉德反应的中后期进行。增加蛋白质的聚集和焦糖化反应从而加剧糖基化的反应进程，致使蛋白质的一些功能特性减弱，影响蛋白的功能特性[15]。然而，在美拉德反应中反应初期得到的产物较为温和，不仅不会减弱功能性质，还能够增加蛋白质的乳化性能[16]。

2.2 游离氨基含量的变化

游离氨基酸的含量能够表明美拉德反应的进程及糖的活性，能够反应美拉德反应初期阶段的进程情况[17]。不同糖与TBPH形成共聚物的游离氨基含量如表1。

未加热的TBPH游离氨基的含量为2.75 mmol/g蛋白，而加热后的TBPH游离氨基的含量降到2.29 mmol/g蛋白，这可以解释为氨基酸之间发生了交联引起了游离氨基含量降低[18]。TBPH和还原糖的反应12 h后游离氨基酸的含量显著降低（P＜0.05）。说明氨基和羰基相互结合，具有糖基化反应产物生成。3种还原糖中小分子的葡萄糖与TBPH生成的游离氨基含量为1.58 mmol/g蛋白，显著低于麦芽糊精及葡聚糖与TBPH生成的游离氨基含量。可见葡萄糖与TBPH的进行美拉德反应时的反应活性要高于大分子的麦芽糊精及葡聚糖的[19]。这可以解释为分子较大的糖醛基的量较少，并具有一定的空间位阻影响了美拉德反应的进程。

表1 苦荞蛋白水解物与还原糖反应生成游离氨基的含量Table 1 The content of free amino in tartary buckwheat protein hydrolysate reacted with reducing sugar

2.3 乳化活性和乳化稳定性

TBPH与还原糖发生糖基化反应后，EAI和ESI的变化情况（P＜0.05），见表 2。

表2 苦荞蛋白水解物与还原糖反应产物的乳化活性和乳化稳定性Table 2 EAI和ESI of reaction product of TBPH and reducing sugar

表2中显示，TBPH与还原糖发生糖基化反应后EAI和ESI显著提高（P＜0.05），这可以解释为蛋白与糖形成的共聚物能够减弱油相和水相的界面张力，形成致密的界面膜。糖分子能够与水相中的水分子产生水和作用，增强空间位阻的同时还能产生更为厚实的界面膜，进一步阻碍聚集现象的发生[20]。3种还原糖中葡聚糖的乳化性最好，这是因为葡聚糖的分子链较长，可形成网状结构增加亲水基团和疏水基团的平衡，对TBPH的结构进一步进行修饰，提高液滴的稳定性并能够防止聚集[21]。除此之外，大分子的糖类还能够起到增稠的作用，能够抵御外部环境的破坏[22]。然而，小分子的葡萄糖与TBPH发生的美拉德反应较为活跃，打破了亲水基团和疏水基团之间的平衡，减弱了TBPH在界面的吸附能力，因此共聚物的乳化性能并没有被提高[23]。

2.4 乳状液的粒径和电势

TBPH反应在不同乳化体系生产的共聚物，其粒径和ζ-电势的变化情况，如表3。

表3 TBPH-糖共聚物制备乳状液的粒径和电势值（5 mg/mL）Table 3 Particle size and ζ-potential of emulsions prepared with TBPH-saccharide conjugates（5 mg/mL）

乳化液滴的粒径大小能够直接反应出乳化剂的乳化效果，即液滴的粒径值越小，乳化颗粒越为分散，乳化剂的乳化性能越优越。从表3中不难看出，与TBPH为乳化剂相比，TBPH与还原糖反应生产的共聚物粒径均显著降低（P＜0.05），并且TBPH与葡聚糖反应的共聚物形成乳状液具有最小的粒径。这是因为TBPH-葡聚糖共聚物制备乳状液时，不仅有多肽吸附到了脂滴表面，还有分子链较大的葡聚糖一同吸附到了液滴表面，此时产生了较大的空间位阻，减少了聚集现象的发生[24]。

ζ-电势是反应乳化液滴粒子间静电相互作用的一个重要物理指标。当乳状液液滴间具有较高的ζ-电势值就说明脂滴间具有较大的静电排斥力，能够使液滴彼此远离，从而起到稳定乳状液的目的[25]。如表3，以TBPH为乳化剂制备的乳状液的ζ-电势值为-16.58 mV，而以TBPH与3种还原糖形成共聚物制备的乳状液带有更多的负电荷，并且TBPH-葡聚糖共聚物为乳化剂制备的乳状液ζ-电势值最大，为-24.02 mV。可见，共聚物制备乳状液的带电量明显提高（P＜0.05）。但是以TBPH作为乳化剂分散的乳状液带电量显著降低（P＜0.05）。这就说明了相比TBPH，TBPH-葡聚糖共聚物不仅有较好的乳化活性，还具有更高的乳化稳定性。

2.5 乳状液的氧化稳定性

TBPH-糖共聚物制备乳状液，其稳定性用储藏时间在10 d以内的TBARS值的变化来确定，如图2。

图2 TBPH-糖共聚物制备乳状液的TBARS值（5 mg/mL）Fig.2 TBARS of emulsions prepared with TBPH-saccharide conjugates（5 mg/mL）

从图2能够看出，TBPH与TBPH-葡聚糖共聚物制备的乳状液均能够起到提高体系氧化稳定性的效果。相比于TBPH，TBPH与还原糖反应生成的共聚物更够更好的抑制脂质氧化。其中，TBPH与葡聚糖生成的共聚物抑制脂质氧化的最好。这是因为TBPH和葡聚糖发生美拉德反应生成的共聚物亲水基团和疏水基团更为平衡，具有更强的自由基清除能力[26]。此外，TBPH与大分子糖能够结合在一起形成更为致密的界面膜，能够较好的防止油脂进一步氧化[27]。虽然，美拉德反应的过程中会消耗氨基，降低自由基的清除能力。但温和的美拉德反应对自由基的清除能力影响不大，并能够通过增加黏度来增加乳状液的稳定性[28]。可见，TBPH-葡聚糖共聚物不仅具有较好的乳化活性和乳化稳定性，还保留了TBPH原有的抗氧化活性，并能通过乳化稳定性进一步提高乳化体系的稳定性。

3 结论

通过筛选最终确定美拉德反应条件为2%TBPH、10%糖、pH 7.0、反应时间为12 h。3种还原糖与TBPH形成的共聚物乳化性能都被显著提高。但与葡萄糖和麦芽糊精相比，TBPH与葡聚糖发生的美拉德反应为最温和，游离氨基含量最高，乳化活性和乳化稳定性最高并且形成乳状液的粒径、电势和氧化稳定性最好，同时还能一定程度的提高TBPH原有的抗氧化能力。并且，糖分子链越长与TBPH形成共聚物的乳化性能就越好。