(扬州工业职业技术学院 化学工程学院，江苏 扬州 225127)

五甲川菁染料（Cy5）是菁染料中一类能够增强感光材料感光性的重要荧光染料，摩尔消光系数较大，其吸收波长和发射波长一般在650nm～750nm，属于可见光至近红外范围内，因此其属于近红外染料。同时在基因诊断（DNA 诊断或分子诊断）、蛋白质标记（基因的表达）、临床诊断（离子和中性小分子的识别、细胞、组织以及活体成像）等方面广泛应用。

Waggoner 等[1]合成了N-羧基-5-磺酸盐-3H-吲哚菁染料Cy3 和Cy5，染料分子中的羧基与生物大分子中的氨基共价结合，形成新的化学键，因此具有良好的荧光性和水溶性，已成为生物芯片上新一代先进的商业化荧光探针。郑洪等[2]用自合成法合成水溶性近红外试剂七甲基花菁作为显色探针，标识出近红外区的血清蛋白质。Mccorquodale 等[3]证实ICG（吲哚菁绿）可用于检测人体血清蛋白及其他蛋白质，通过二极管诱发激光毛细管电泳荧光（CEIF）进行表征。研究表明：合成的ICG（吲哚菁绿）具有长吸收波长、强荧光特性的优点，因此在医学检测中也得到了广泛的应用。Sowell 等[4]使用水溶性吲哚菁染料作为人血清蛋白的示踪剂和非共价标记物，用毛细管电泳法测定不同药物对人血清蛋白结合能力的强弱。研究[5-6]发现吲哚菁染料最佳的缓冲溶液是pH 值为9.0 的硼酸盐，同时对布洛芬、奎纳定、萘普生、丙咪嗪等药物进行检测分析，结果表明：药物与人体血清蛋白的结合对药物的毒性、活性和人体排泄有一定的影响。

目前，菁染料还有着一些问题：水溶性差、分离提纯困难、耐光耐热性差等，严重影响了菁染料的应用，针对这些问题，主要解决办法有两种，一是研发出有着更长的吸收波长的新型功能菁染料；二是通过改变菁染料的分子结构，来增强它的稳定性，从而拓宽其应用范围。

本文主要是在3-丙烯醛缩苯胺两端加入中间体1-间羧苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉和1-间羧苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾。采用薄层色谱法点样、展开后，根据比移值（Rf）与合适的对照物按相同方法所得的色谱图的比移值（Rf）作对比之后，确定需要的菁染料组成，研究菁染料的性能变化。

1 实验部分

1.1 实验药品

1-间羧苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉、1-间羧苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾、3-丙烯醛缩苯胺（分析纯，湖北巨胜科技）；N，N 二甲基甲酰胺（DMF）（分析纯，南京仁恒化工）；二甲基亚砜（DMSO）(分析纯，南京苏研化工科技)；四氢呋喃、乙酸乙酯、无水乙醇、二氯甲烷、甲醇、丙酮（分析纯，常州中奥化工）；乙腈、氯仿（分析纯，宜兴市迈克化工）；乙酸酐、冰乙酸（分析纯，苏州玖佳化工）。

1.2 实验仪器

集热式恒温磁力搅拌器DF-101S，电子天平FA/JA（巩义市英峪予华仪器厂）；旋转蒸发器RE-201D（上海民桥精密仪器有限公司分析仪器厂）；双五金电热鼓风干燥箱101A-1E（上海实验仪器厂有限公司）；真空干燥箱TP-620A（上海精密实验设备有限公司）；紫外-可见分光光度计UV-2550、荧光光谱仪RF5000（日本岛津公司）；液质联用色谱仪HP1100LC-MCSD（安捷伦公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料的合成

用实验室现有的染料中间体1-间羧苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾和缩合剂3-丙烯醛缩苯胺作为原料，在一定反应条件下发生缩合反应，得到相应的对称性五甲川菁染料Cy5，结构如图1 所示。

图1 5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料的基本结构及合成路线Fig.1 Basic structure and synthetic route of 5-sulfonic acid N-ethyl Cy5 cyanine dye

溶剂为冰乙酸，催化剂为乙酸酐，反应温度为110℃，反应时间4h，反应过程中N2保护。取50mL 小烧瓶，将冰乙酸和乙酸酐以1：1 配比加入，即加入13mL 的冰乙酸和13ml 的乙酸酐，即再将摩尔比为2（中间体）：1.1（缩合剂）即187.4mg 的中间体和200mg 的缩合剂加入小烧瓶，再放入磁性转子，置于加热炉上加热，加热时不断搅拌，加热温度到达110℃时开始计时，反应时间4h。反应结束后，将小烧瓶取下静置冷却到室温，将其中剩余液体采用旋干蒸馏的方式的旋干，剩余固体样品用二氯甲烷溶解后保存，用柱色谱法进行分离提纯。

1.3.2 N-乙基Cy5 菁染料的合成

用实验室现有的染料中间体1-间羧苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉和缩合剂3-丙烯醛缩苯胺作为原料，合成后的结构如图2 所示。

图2 N-乙基Cy5 菁染料的基本结构及合成路线Fig.2 Basic structure and synthetic route of N-ethyl Cy5 cyanine dye

取50mL 小烧瓶，将冰乙酸和乙酸酐以1（冰乙酸）：1（乙酸酐）配比加入，即加入13mL 的冰乙酸和13mL的乙酸酐，再将摩尔比为2（中间体）：1.1（缩合剂）即249.5mg 的中间体和200mg 的缩合剂加入小烧瓶，再放入磁性转子，置于加热炉上加热，加热时不断搅拌，加热温度到达110℃时开始计时，反应时间4h。反应结束后，将小烧瓶取下静置冷却到室温，将其中剩余液体采用旋干蒸馏的方式的旋干，剩余固体样品用二氯甲烷溶解后保存，用柱色谱法进行分离提纯。

1.4 表征方法

1.4.1 菁染料的分离方法

采取薄层色谱制板和展开，柱层析制作和分离，在色谱柱中不断加入洗脱剂，样品逐渐向下分离，收集流出液，用甲醇萃取，萃取后的染料甲醇溶液采用旋干蒸馏的方法旋干，最后留下的固体即较纯净的菁染料。

1.4.2 质谱及光学性能检测

用液质联用色谱仪及核磁共振来表征化合物结构，同时在紫外分光光度计上设定扫描光谱范围是370nm～900nm，波长间隔为1nm，时间间隔为1s，测定染料在不同有机溶剂下的的紫外可见吸收光谱。

1.4.3 滴定实验

选用在无磺酸基的菁染料乙腈溶液中对Cu2+离子的滴定，以得出Cu2+离子使菁染料在乙腈溶液中可以识别时的最佳浓度。在小瓶中配置1×10-5mol/L 的菁染料乙腈溶液，测紫外可见吸收波长，作为空白对比数据，使用量程为0.5μL～2.5μL 的移液枪。在溶液内浓度梯度为0.3 当量地加入1×10-2mol/L 的Cu2+离子，观察其紫外可见吸收波长的变化，记录并处理数据。

1.4.4 菁染料试纸制作

配置浸泡液，裁剪试纸，取出试纸，晾干并选取颜色分布均匀的纸条，将其裁剪成规格为1cm×1cm 的纸片，将纸片均匀放在玻璃板上，分别滴加一定量的金属离子溶液，溶液要求完全浸湿纸片即可，等被金属离子溶液浸湿的纸片晾干后，滴加乙腈，使乙腈将纸片完全浸湿，静置晾干观察是否有颜色变化。

2 结果与讨论

2.1 菁染料的质谱分析

分离纯净后5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料的收率为36 %。1H NMR (400 MHz，DMSO-d6)，δ:8.29 (t，1H，J=11.0 Hz，CH=CH),7.76 (s，2H，Ar-H)，7.65 (d，2H，J=8.0 Hz，Ar-H)，7.35 (d，2H，J=4.4Hz，Ar-H)，6.64(d，2H，J=12.0 Hz，CH=CH)，4.25～4.35 (m，4H，N-CHZ)，1.67 (s，12H,C(CH3)Z)。HRMS (TOF MS ES)calculated for C29H33N2K2(SO3)2H NMR 谱图如图3 所示。

图3 5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料1H NMR 谱图Fig.3 1H-NMR spectrum of 5-sulfonic acid N-ethyl Cy5 cyanine dye

分离纯净后N-乙基Cy5 菁染料的收率为28.3 %。1H NMR (400 MHz，DMSO-d6)，δ:8.28 (t，1H，J=11.0 Hz，CH=CH),7.76 (s,2H，Ar-H)，7.64 (d，2H，J=8.0 Hz，Ar-H)，7.36 (d，2H，J=4.4Hz，Ar-H)，6.65～6.62 (d，2H，J=12.0 Hz，CH=CH)，4.20～4.35 (m，4H，N-CHZ)，1.67 (s，12H,C(CH3)Z).HRMS (TOF MS ES)calculated for C29H33N2H NMR 谱图如图4 所示。

图4 N-乙基Cy5 菁染料1H NMR 谱图Fig.4 1H-NMR spectrum of N-ethyl Cy5 cyanine dye

2.2 两种菁染料的紫外-可见光谱分析

一共选取了实验室常见的14 种有机溶剂，分别检测了合成的两种菁染料在14 种有机溶剂中的溶解性，检测结果见表1。

表1 两种菁染料溶解性检测结果Tab 1 Test results of two cyanine dyes

在筛选出的溶解性较好的有机溶剂中进行了金属离子检测，检测的金属离子有：Ca2+、K+、Mn2+、Cu2+、Ni2+、Cr2+、Cu+、Al3+、Fe2+、Na+、Mg2+、Ag+、Zn2+、Hg2+、Fe3+、Ni2+、Pb2+、Ni2+、Sn2+、Sn4+、Ce3+、Co2+、Cd2+和乙醇（防止乙醇清洗比色皿时对实验结果产生影响，作为对比数据）。

5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料在乙腈、乙醇、水、甲醇、DMSO、DMF 和丙酮七种有机溶剂中溶解性较好，紫外-可见光谱谱图如图5 所示。N-乙基Cy5 菁染料在乙酸乙酯、四氢呋喃、乙腈、乙醇、氯仿、甲醇、DMSO、DMF 和丙酮九种有机溶剂中溶解性较好，紫外光谱谱图如图6 所示。

图5 5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料的紫外-可见光谱谱图Fig.5 UV-visible spectrum of 5-sulfonic N-ethyl Cy5 cyanine dye.

图6 N-乙基Cy5 菁染料的紫外-可见光谱谱图Fig.6 UV-visible spectrum of N-ethyl Cy5 cyanine dye

由图5、图6 可以看出，5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料在七种有机溶剂中的紫外-可见吸收波长分别为：640nm、641nm、635nm、634nm、646nm、645nm 和643nm；N-乙基Cy5 菁染料在九种有机溶剂中的紫外吸收波长分别为：640nm、636nm、640nm、641nm、642nm、634nm、646nm、645nm、643nm。

由图7、图8 可知，5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料在乙腈溶液中，由多个金属离子发生了荧光淬灭，同时紫外可见吸收谱图中由一个峰变成了两个峰。这是因为在乙腈溶液中，菁染料一般为单聚体的形式存在，当加入金属离子后，单聚体变成了二聚体甚至是多聚体，从而导致谱图的变化及菁染料乙腈溶液的颜色变化。但是加入金属离子后菁染料本身没有发生变化，只是物质聚集状态发生了变化，并且有多个金属离子使它发生了变化，所以无法证明磺酸基菁染料对哪个金属离子有识别能力。

图7 有磺酸基菁染料在乙腈中的紫外谱图Fig.7 UV spectrum of sulfocyanine dye in acetonitrile

图8 有磺酸基菁染料在乙腈中的荧光谱图Fig.8 Fluorescence spectrum of sulfocyanine dye in acetonitrile

N-乙基Cy5 菁染料在乙腈溶剂中加入金属离子的紫外可见和荧光光谱谱图分别如图9、图10 所示。

图9 无磺酸基菁染料在乙腈中的紫外谱图Fig 9 UV spectrum of sulfonate-free cyanine dye in acetonitrile

图10 无磺酸基菁染料在乙腈中的荧光谱图Fig 10 Fluorescence spectrum of sulfonate-free cyanine dye in acetonitrile

由图9、图10 可知，N-乙基Cy5 菁染料在乙腈溶液中，只有加入Cu2+离子后其光谱发生了变化，而加入其他金属离子并未对菁染料有影响。经观察，在N-乙基Cy5 菁染料乙腈溶液内滴加Cu2+离子后颜色褪去接近无色透明，由此可以证明，N-乙基Cy5 菁染料在乙腈溶液中对Cu2+离子有着特殊的识别能力。在筛选出有这种特殊识别能力之后，加做滴定实验，确定能使N-乙基Cy5菁染料褪色的Cu2+离子最大浓度。滴定结果如图11 所示。

图11 Cu2+离子滴定菁染料的紫外可见光谱谱图Fig 11 UV-Vis spectrum of Cu2+ ion titration of cyanine dye

由图11 可知，当Cu2+离子浓度不断增大时，紫外波峰不断降低，其紫外吸收波长也不断减小，这是因为滴加Cu2+离子之后，Cu2+离子对N-乙基Cy5 菁染料本身发生了反应，不仅使紫外可见吸收波长发生变化，同时也使溶液颜色褪色至无色。

通过浓度梯度滴加Cu2+离子直至新生成的波峰不再发生变化，记录Cu2+离子的浓度为1×10-2mol/L，即在1×10-5mol/L 的N-乙基Cy5 菁染料乙腈溶液中，1×10-2mol/L 浓度的Cu2+离子可使溶液颜色褪至无色。

2.3 菁染料试纸的制作

按照步骤制作好的试纸，结果如图12 所示。

图12 Cu2+离子滴加N-乙基Cy5 菁染料乙腈试纸Fig.12 The test paper of Cu2+ ions with N-ethyl Cy5 cyanine dye acetonitrile

由图12 可知，在选用试纸制作以后，并没有出现颜色褪去的现象。这可能是因为当试纸被菁染料浸泡过后，菁染料附着在了试纸上，成为固定相，当再次滴加离子的时候，离子已经无法再对固定在试纸上的菁染料产生作用。在此基础上又增加了一个溶液检测Cu2+离子的实验，其结果如图13 所示。

图13 N-乙基Cy5 基菁染料乙腈溶液滴加金属离子显色图Fig.13 The appearance of N-ethyl Cy5 based cyanine dye in acetonitrile solution

由此可得，N-乙基Cy5 菁染料只有在乙腈溶液中才有对Cu2+离子的特殊识别能力，这是因为在乙腈溶液溶液中，菁染料处于游离状态，Cu2+离子可以与游离态的菁染料发生指示作用，进而引起菁染料的褪色。

3 结论

菁染料(Cy)因在近红外区域有较强的荧光发射且易于修饰，从而近年来被广泛地应用于敏化生物分子、细胞和组织等物质，形成荧光标记的复合体，从而为生物分析、生物成像和疾病(特别是肿瘤)的机理分析和治疗提供了一条非常便利的途径。

本实验研究分别合成了两种Cy5 菁染料，分别是5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料和 N-乙基Cy5 菁染料，对它们产物进行了分离提纯，并测试了它们的光谱性能及离子检测，结论如下：

（1）5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料在乙腈、乙醇、水、甲醇、DMSO、DMF、丙酮七种有机溶剂中的紫外可见吸收波长分别为：640nm、641nm、635nm、634nm、646nm、645nm、643nm。

（2）N-乙基Cy5 菁染料在乙酸乙酯、四氢呋喃、乙腈、乙醇、氯仿、甲醇、DMSO、DMF、丙酮九种有机溶剂中的紫外可见吸收波长分别为：640nm、636nm、640nm、641nm、642nm、634nm、646nm、645nm、643nm。

（3）5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料对金属离子的识别能力较差，达不到识别性能，而N-乙基Cy5 菁染料对金属离子的识别能力较为特殊，只有在特定的溶剂中才对特定的离子有识别能力。

（4）N-乙基Cy5 菁染料相对较稳定，在大多数有机溶剂中可溶，加入金属离子后对其性质无影响，N-乙基Cy5 菁染料在乙腈溶液内，对Cu2+离子有一定的识别能力，但是在试纸上实验不行，只有游离态的菁染料对Cu2+离子有识别能力。