曹 冶，于吉峰，谢 晶 ，张先惠，彭广能，钟志军，康润敏

(1.四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066；2. 动物遗传育种四川省重点实验室，四川 成都 610066；3.四川农业大学动物医学院，四川 成都 611130)

【研究意义】近年来，随着国民经济的快速发展，人们生活水平的不断提高，伴侣动物特别是宠物犬和猫的数量增长迅猛。据统计，2018年我国城镇养狗人数达3390万，且宠物行业依然保持着27 %的年增长速率[1]，如何保证其健康已成为宠物行业面临的重大问题。维生素A又称视黄醇(其醛衍生物视黄醛)，是一个具有酯环的不饱和一元醇，是人类与动物所必需的营养素[2]。维生素A中毒是由于动物长期过量摄入富含维生素A的食物，引起维生素A过剩症，在伴侣动物的养殖过程中时有发生，主要是由于饲喂全价日粮的同时长期大量饲喂肝脏，致使维生素A在动物体内发生蓄积，其临床症状主要表现为骨质疏松，易骨折，韧带和肌腱附着处的骨膜发生增生性病变，被毛稀疏、易脱等，特别是幼年动物极易出现四肢关节肿胀、跛行等骨骼发育不良等症状[3-5]，但目前尚无治疗动物维生素A中毒的特效药物。因此，研发能有效治疗动物维生素A中毒的药物对确保伴侣动物医疗健康发展具有重要意义。【前人研究进展】维生素A主要储存在动物肝脏中，过量维生素A会导致肝肿大、坏死等病理变化[6-7]；在其他组织中也存在维生素A储存，但不同动物间的肝外维生素A储存差异明显[8-11]。这可能是由于维生素A的状态及改变维生素A状态或代谢的潜在疾病过程所造成，有望成为动物维生素A中毒诊断的潜在手段。虽然已证实过量摄入维生素A与骨骼发育不良等症状存在关联，但导致中毒的摄入量尚无法确定，可能还与其他营养因素协同发挥作用导致中毒有关[12-16]。对于动物维生素A中毒目前尚无特效的诊断和治疗方法，以犬为例，主要是立即停止饲喂富含维生素A的食物(动物肝脏等)或饲料，并进行对症治疗。对于关节肿胀、跛行的患犬，可按照0.5～1.0 mg/kg的剂量肌肉注射地塞米松，每天 1次，连用3～5 d，同时肌肉注射维生素B1、B6和B12混合液；或口服安宫牛黄丸(1/3粒，约1.0 g)和大活络丸(1/3粒，约1.2 g)，每天2次，连用15 d。但临床实践证明，这些治疗效果并不理想[17]。本课题组的前期研究发现，小鼠在维生素A急性中毒4周左右开始出现关节肿胀、跛行等症状，在其生化指标上表现为血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性达峰值，血清钙(Ca)含量达峰值；急性中毒8周左右，症状愈加明显，而血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血清钙仍居高不下。因此，把小鼠在生素A的急性中毒8周左右认定为维生素A的急性中毒中晚期。【本研究切入点】我国中药资源非常丰富，且有着悠久的中药用药历史，若能从寻找到治疗维生素A早期急性中毒的药物及组方，对解决伴侣动物健康喂养问题具有重要意义。【拟解决的关键问题】研究中药提取物及其组方对小鼠维生素A中晚期急性中毒的治疗效果，为动物维生素A急性中毒提供有效的治疗手段，进而促进伴侣动物医疗的健康发展。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康成年昆明种小鼠36只，体质量18～22 g，公母各半，购至四川大学华西医院实验动物中心。在25～28 ℃环境种饲养2～3 d后。一次性腹腔注射维生素A(1500 mg/kg计量)，形成急性中毒模型小鼠，作为实验动物。在中毒8周后开始治疗实验。

将维生素A中毒致骨发育不良综合症动物，随机分成6组，每组6只小鼠。第1组为空白对照组(T1)，不给药；第2组为赶黄草水粗提物治疗组(T2)，按10.0 mL/kg的剂量连续灌胃给药7 d；第3组为波棱瓜子粗提油治疗组(T3)，按1.0 mL/kg的剂量连续灌胃给药7 d；第4组为赶黄草水粗提物+波棱瓜子粗提油治疗组(T4)，按5.0 mL/kg赶黄草水粗提物+0.5 mL/kg波棱瓜子粗提油连续灌胃给药7 d；第5组为赶黄草水粗提物+波棱瓜子粗提油+黄芪多糖治疗组(T5)，按5.0 mL/kg赶黄草水粗提物+0.5 mL/kg波棱瓜子粗提油+1.0 g/kg黄芪多糖(一级品)连续灌胃给药7 d；第6组为阳性对照(T6)，取安宫牛黄丸作为药品(1/3粒，约1 g)，连续灌胃给药7 d。

1.2 中药提取及处理

中药波棱瓜子、赶黄草，一级品，购至成都中药材批发市场。

称取100 g波棱瓜子粉末，用滤纸包好后，放入索氏抽提器中，加入石油醚索氏提取6 h，回收石油醚提取物，旋转蒸干溶剂，得到50 mL波棱瓜子粗提油。

称取100 g赶黄草粉末，用滤纸包好后，放入索氏抽提器中，加入蒸馏水索氏提取6 h，回收提取物，水浴蒸干溶剂，用蒸馏水重溶，得到60 mL赶黄草水粗提物。

1.3 实验方法及试剂

实验小鼠在治疗开始第2、4、6、8天分别采静脉血进行血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、钙(Ca)、碱性磷酸酶(ALP)、甲状腺旁素(PTH)测定。

小鼠谷丙转氨酶(ALT)测定试剂盒、小鼠血清谷草转氨酶(AST)测定试剂盒、小鼠血清碱性磷酸酶(ALP)测定试剂盒、小鼠血清甲状腺旁素(PTH)测定试剂盒购至武汉优尔生科技股份有限公司。小鼠血清钙(Ca)测定试剂盒、小鼠血清磷(P)测定试剂盒购至南京建成生物工程研究所。黄芪多糖(一级品)购至华牧康兽药商城。石油醚、乙醇均为分析纯。

1.4 测定

取分离后的血清0.2 mL，按试剂盒所述方法进行测定AST，ALT，Ca，P，ALP，PTH。

1.5 数据处理

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，差异显著时用ANOVA过程进行多重比较，以P<0.01(差异极显著)和P<0.05(差异显著)作为差异显著性判断标准，数据以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 对维生素A急性中毒小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)的影响

从表1可知，通过对维生素A急性中毒小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)测定发现，T1组的血清ALT未见明显变化，第2、4、6、8天分别为(10.66±0.28)、(9.90±0.30)、(9.79±0.14)、(10.26±0.51)ng/mL；T2组从第6天开始下降，全期有轻度下降，第2、4、6、8天分别为(8.76±0.29)、(8.58±0.26)、(7.73±0.29)、(7.04±0.06)ng/mL；T3组全期有明显下降，第2、4、6、8天分别为(9.75±0.23)、(8.23±0.17)、(6.80±0.11)、(4.56±0.16)ng/mL；T4组全期有更为明显下降，第2、4、6、8天分别为(9.92±0.20)、(6.72±0.29)、(4.36±0.14)、(3.11±0.02)ng/mL；T5组为所有治疗方式中下降最为明显的，第2、4、6、8天分别为(10.01±0.2)、(6.68±0.19)、(4.33±0.14)、(2.84±0.12)ng/mL；T6组效果也非常明显，第2、4、6、8天分别为(11.17±0.08)、(7.14±0.21)、(5.24±0.17)、(3.70±0.10)ng/mL。

2.2 对维生素A急性中毒小鼠血清谷草转氨酶(AST)的影响

从表2可知，通过对维生素A急性中毒小鼠血清谷草转氨酶(AST)测定发现，T1组的血清AST未见明显变化，第2、4、6、8天分别为(1892.51±35.91)、(1776.75±67.54)、(1756.16±20.47)、(1893.43±43.37)pg/mL；T2组全期下降明显，第2、4、6、8天分别为(2146.15±66.87)、(1774.14±56.46)、(1272.85±5.71)、(843.97±15.85)pg/mL；T3组全期下降缓慢，第2、4、6、8天分别为(1743.40±49.45)、(1518.96±49.75)、(1240.57±35.84)、(866.26±37.89)pg/mL；T4组全期有较为明显下降，第2、4、6、8天分别为(2173.82±25.74)、(1226.74±81.64)、(901.92±40.52)、(489.48±5.25)pg/mL；T5组为所有治疗方式中下降也比较明显，第2、4、6、8天分别为(1790.28±64.39)、(1291.45±93.86)、(840.12±93.86)、(519.00±41.57)pg/mL；T6组效果就比较一般，第2、4、6、8天分别为(1930.94±122.11)、(1658.08±23.21)、(1492.68±39.29)、(1180.46±41.49)pg/mL。

表1 各种药物治疗维生素A急性中毒小鼠的血清谷丙转氨酶变化情况

表2 各种药物治疗维生素A急性中毒小鼠的血清谷草转氨酶变化情况

表3 各种药物治疗维生素A急性中毒小鼠的血清钙变化情况

2.3 对维生素A急性中毒小鼠血清钙(Ca)的影响

从表3可知，通过对维生素A急性中毒小鼠血清钙(Ca)测定发现，T1组的血清Ca未见明显变化，第2、4、6、8天分别为(11.01±0.31)、(10.74±0.27)、(11.16±0.40)、(11.15±0.45)mmol/L；T2组有较为明显的下降，第2、4、6、8天分别为(11.29±0.38)、(9.80±0.47)、(6.98±0.32)、(3.94±0.37)mmol/L；T3组趋势与赶黄草水粗提物治疗组相似，第2、4、6、8天分别为(12.03±0.48)、(8.58±0.36)、(6.05±0.83)、(4.20±0.38)mmol/L；T4组全期明显下降，第2、4、6、8天分别为(12.36±0.52)、(7.31±0.77)、(3.77±0.29)、(2.59 ±0.61)mmol/L，第6天后回到正常值。T5组也下降明显，趋势与赶黄草水粗提物+波棱瓜子粗提油治疗组相似，第2、4、6、8天分别为(11.55±0.32)、(7.58±0.28)、(4.33±0.32)、(2.91±0.29)mmol/L；T6组无显著变化，第2、4、6、8天分别为(12.31±0.60)、(12.31±0.42)、(12.25±0.40)、(12.61±0.40)mmol/L。

2.4 对维生素A急性中毒小鼠血清磷(P)的影响

从表4可知，通过对维生素A急性中毒小鼠血清磷(P)测定发现，T1组的血清P未见明显变化，第2、4、6、8天分别为(2.64±0.13)、(2.37±0.06)、(2.39±0.07)、(2.42±0.11)mmol/L；T2组有较为明显的下降，第2、4、6、8天分别为(3.15±0.12)、(3.43±0.22)、(2.71±0.10)、(2.27±0.14)mmol/L；T3组趋势与赶黄草水粗提物治疗组相似，第2、4、6、8天分别为(3.54±0.10)、(3.14±0.04)、(2.72±0.07)、(1.96±0.10)mmol/L；T4组全期明显下降，第2、4、6、8天分别为(3.09±0.10)、(3.36±0.30)、(2.69±0.08)、(2.07±0.08)mmol/L；T5组也下降明显，趋势与赶黄草水粗提物+波棱瓜子粗提油治疗组相似，第2、4、6、8天分别为(3.19±0.11)、(3.85±0.12)、(1.97±0.07)、(1.98±0.12)mmol/L；T6组无显著变化，第2、4、6、8天分别为(3.21±0.18)、(3.43±0.20)、(3.28±0.15)、(3.23±0.11)mmol/L。

表4 各种药物治疗维生素A急性中毒小鼠的血清磷变化情况

图1 各种药物治疗维生素A急性中毒小鼠的血清钙磷比变化情况

本次实验采用药物治疗降低维生素A急性中毒所致小鼠骨症状时，波棱瓜子粗提油和赶黄草水粗提物导致了血清中的钙磷比提高，两者联合后，血清中的钙磷比进一步提高(图1)。

2.5 对维生素A急性中毒小鼠血清碱性磷酸酶(ALP)的影响

从表5可知，通过对维生素A急性中毒小鼠血清碱性磷酸酶(ALP)测定发现，T1组的血清ALP未见明显变化，第2、4、6、8天分别为(8.54±0.16)、(8.65±0.19)、(8.84±0.30)、(8.82±0.39)ng/mL；T2组，全期下降明显，第2、4、6、8天分别为(9.66±0.23)、(7.42±0.63)、(5.76±0.35)、(2.98±0.19)ng/mL；T3组也有明显下降，相较于其它治疗组要缓慢性，第2、4、6、8天分别为(10.24±0.33)、(7.42±0.17)、(5.60±0.23)、(4.14±0.47)ng/mL；T4组全期有明显下降，速度与处理2、处理5差不多，第2、4、6、8天分别为(9.82±0.44)、(5.42±0.35)、(3.04±0.33)、(1.72±0.39)ng/mL；T5组下降也较为明显，第2、4、6、8天分别为(9.52±0.90)、(6.15±0.42)、(3.44±0.62)、(2.06±0.43)ng/mL；T6组效果也比较明显，稍逊于处理2、处理4、处理5，第2、4、6、8天分别为(9.61±0.72)、(7.64±0.38)、(6.91±0.22)、(4.51±0.27)ng/mL。

2.6 对维生素A急性中毒小鼠血清甲状腺旁素(PTH)的影响

从表6可知，通过对维生素A急性中毒小鼠血清甲状腺旁素(PTH)测定发现，T1组的血清PTH未见明显变化，第2、4、6、8天分别为(110.51±14.83)、(123.71±5.14)、(139.95±11.67)、(133.88±5.77)pg/mL；T2组全期升高明显，第2、4、6、8天分别为(106.17±12.91)、(188.96±26.82)、(251.71±10.41)、(287.63±13.03)pg/mL；T3组也有明显升高，趋势与处理2类似，第2、4、6、8天分别为(135.31±3.58)、(183.19±9.58)、(263.31±2.99)、(317.07±8.27)pg/mL；T4组全期升高较为迅速，第2、4、6、8天分别为(193.90±10.14)、(281.80±10.24)、(295.84±9.75)、(351.15±8.69)pg/mL；T5组升高也比较明显，趋势与处理4类似，第2、4、6、8天分别为(194.67±6.77)、(285.25±4.85)、(304.11±9.99)、(348.95±5.49)pg/mL；T6组效果有轻度升高，第2、4、6、8天分别为(97.90±5.40)、(108.66±16.86)、(119.31±10.90)、(129.60±16.03)pg/mL。

表5 各种药物治疗维生素A急性中毒小鼠的血清碱性磷酸酶变化情况

表6 各种药物治疗维生素A急性中毒小鼠的血清甲状腺旁素变化情况

3 讨 论

赶黄草(PenthorumchinensePursh.)又名扯根菜、水泽兰、水杨柳等，为虎耳草科植物扯根菜的地上部分，是苗族民间治疗肝病的经验方，具有清热解毒、退黄化湿、活血散瘀及利水消肿等功效[18-19]。波棱瓜子为葫芦科植物波棱瓜[Herpetospermumcaudigerum(Ser.) C. B. Clarke]的干燥成熟种子，是一种常用藏药，具有清胆热、泻肝火及治疗消化不良等功效[20-21]。鉴于此，本研究选用波棱瓜子粗提油和赶黄草水粗提物治疗维生素A急性中毒小鼠，结果显示，赶黄草水粗提物和波棱瓜子粗提油均具有治疗维生素A急性中毒所致小鼠骨损伤的功效。而二者合用且配以免疫增强剂黄芪多糖一起治疗维生素A急性中毒，不仅可治疗维生素A急性中毒所致小鼠骨损伤，而且还可治疗维生素A急性中毒所致肝损伤，不仅能修复肝损伤，还能加快坏死的肝细胞代谢，从而达到纠正肝功能的目的。赶黄草水粗提物+波棱瓜子粗提油+黄芪多糖治疗维生素A急性中毒效果大大优于阳性对照组安宫牛黄丸。

谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)是衡量动物肝功能的2个重要的生化指标。其中ALT主要存在于肝细胞浆内， AST主要分布在肝细胞浆和肝细胞的线粒体中。正常时，只有少量释放入血液中；肝细胞坏死时，ALT和AST就会大量释放入血液中，血清中浓度升高，其升高的程度与肝细胞受损的程度相一致。在肝功能检查中，ALT是反映肝细胞受损的指标的，而AST是反映肝细胞坏死的标准[22-23]。从本次实验的结果来看，波棱瓜子粗提油对降低维生素A急性中毒所致ALT升高效果略优于赶黄草水粗提物，两者的联合作用的效果由进一步的提高，优于单个作用组，在其中加入黄芪多糖，效果进一步提升，略优于安宫牛黄丸。在所有参试治疗方案中达到最佳。这可能是由于黄芪多糖具有激发自身免疫力的功效所致。而对于AST而言，赶黄草水粗提物对降低维生素A急性中毒所致AST升高效果最佳，优于波棱瓜子粗提油，略优于两者混合。均优于安宫牛黄丸的疗效。总体而言，赶黄草水粗提物+波棱瓜子粗提油+黄芪多糖治疗维生素A急性中毒所致肝损伤效果最佳，不但能修复肝损伤，也能加快坏死的肝细胞代谢，从而达到纠正肝功能的目的，效果大大优于对照组安宫牛黄丸。

钙，磷是构成动物骨组织的重要组成元素，约80 %的磷，99 %以上的钙以磷酸钙形式贮存在骨骼中。游离的血清钙、磷浓度升高和降低均在某种程度上反映了动物骨组织出现的变化[24]。在前期的研究中发现：小鼠出现骨症状时，其血清钙大幅升高，血清磷有小幅升高，从而导致血清中钙磷比大幅升高。从本次实验的结果来看，波棱瓜子粗提油和赶黄草水粗提物均能大幅降低维生素A急性中毒所致小鼠血清钙、磷浓度，两者联合，效果更佳，降低幅度更大。而对照组安宫牛黄丸却不具备此项功效，它对降低维生素A急性中毒所致小鼠血清钙、磷浓度功效不彰。但是，本次实验采用药物治疗降低维生素A急性中毒所致小鼠骨症状时，波棱瓜子粗提油和赶黄草水粗提物导致了血清中的钙磷比提高，两者联合后，血清中的钙磷比进一步提高。这可能是由于动物在修复损伤的骨组织时，需要大量的钙磷元素来重构骨组织，而损伤时，只有大量的钙释放出血液中，所以骨组织修复时，为了达到平衡，需摄入更多的磷来补充，从而导致血清中的钙磷比提高。

碱性磷酸酶(ALP)是广泛分布于动物肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶[25]。这种酶能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。目前已发现有ALP1、ALP2、ALP3、ALP4、ALP5与ALP6 6种同功酶。其中第1、2、6种均来自肝脏，第3种来自骨细胞，第4种产生于胎盘及癌细胞，而第5种则来自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。临床上测定ALP主要用于骨骼、肝胆系统疾病的诊断和鉴别诊断，其病理性升高特别反映了肝损伤所致骨损伤的情况。从本次实验的结果来看，赶黄草水粗提物降低维生素A急性中毒所致小鼠血清ALP效果优于波棱瓜子粗提油，两者联合使用时，降低血清ALP效果与赶黄草水粗提物类似，优于对照组安宫牛黄丸。

甲状腺旁素(parathyroid gland，PTH)是含有84个氨基酸残基的直链多肽，分子量为9500，其生物活性取决于氨基端的第1～27位氨基酸残基。PTH是体内维持血钙稳态的主要激素，总的效应是升高血钙和降低血磷水平[26]。反映了血清钙磷比变化情况。本次实验的结果来看，赶黄草水粗提物和波棱瓜子粗提油由于其具有修复维生素A急性中毒所致小鼠骨损伤的功效，所以导致了PTH的显著升高。而两者的联合作用，修复骨损伤效果更强，所以导致了PTH的进一步升高。而安宫牛黄丸不具有修复骨损伤功效，所以PTH浓度变化不大。

总而言之，通过本次实验发现，赶黄草水粗提物和波棱瓜子粗提油均有治疗维生素A急性中毒所致小鼠骨损伤的功效，两者联合使用，效果更佳。特别是赶黄草水粗提物+波棱瓜子粗提油+黄芪多糖的药物治疗组合，疗效最佳。优于传统治疗药物安宫牛黄丸。