李 宁 周珊珊 胡 蕊 高媛媛 王潮敏 王育梅

(河北医科大学第一医院精神卫生科，石家庄 050000)

抑郁症是情绪障碍综合征，严重影响人们身心健康，且具有较高致死率。抑郁症发病时主要通过慢性应激导致前额叶与海马为主的脑区中神经元细胞损伤甚至凋亡，从而损害患者认知功能[1,2]。细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK1/2)作为丝分裂活化蛋白激酶通路的主要组成部分，具有抵抗细胞损伤与促进生长的作用，其表达水平影响患者的行为能力，与抑郁症的发生、发展密切相关[3]。银杏酮酯(ginkgo biloba extract,GBE)作为新型银杏叶提取物制剂，主要成分为银杏黄酮与银杏内酯，能改善模型大鼠抑郁样行为，抑制NLRP3炎症小体活性，减少促炎症因子分泌[4,5]。本实验采用慢性轻度不可预见性应激配合分养建立抑郁大鼠模型，给予不同剂量GBE干预，通过比较各个实验组大鼠前额叶与海马ERK1/2 mRNA与蛋白表达及其磷酸化水平，探讨银杏酮酯对抑郁大鼠行为学的保护作用及其影响机制。

1 材料与方法

1.1实验动物与试剂 SPF级SD大鼠50只，雄性，体重180～220 g，由河北医科大学提供，合格证号：SYXK(冀)2013-0023。除对照组外，其余各组单笼分养，室温下适应性饲养1周，自由摄食与饮水。银杏酮酯(上海杏灵科技药业有限公司)；ERK1/2、p-ERK1/2激酶活性定量检测试剂盒(美国Cell Signaling公司)；β-actin抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2方法

1.2.1动物模型的建立 采用慢性轻度不可预见性应激配合分养法建立抑郁大鼠模型[6,7]。造模前对各组大鼠进行旷场试验、糖水消耗试验。造模大鼠单笼饲养，每天随机接受1种不同刺激，包括2 h束缚行为、45°倾笼、24 h湿笼、连续5次/1 min电击足底30次、4℃冰水游泳5 min、4℃热水游泳5 min、夹尾5 min、24 h禁水、24 h禁食、昼夜颠倒24 h，连续造模21 d。

1.2.2分组与给药 将大鼠随机分为5组，分别为对照组、模型组、银杏酮酯低、中、高剂量组，每组10只。除对照组外，模型组与银杏酮酯低、中、高剂量组大鼠均进行造模处理。造模成功后，银杏酮酯低、中、高剂量组大鼠分别灌胃50、100、200 mg/(kg·d)的银杏酮酯，连续给药28 d。对照组与模型组给予等体积的生理盐水。

1.2.3糖水消耗试验 撤去食物和水，于笼子中央放置相同体积1%蔗糖水和饮用水，观察大鼠5 h自由饮水情况。5 h后交换蔗糖水与饮用水位置，继续观察大鼠5 h，计算糖水摄入百分比：摄入蔗糖水百分比=蔗糖水量/(蔗糖水量+饮用水量)×100%。

1.2.4旷场试验 采用80 cm×80 cm×60 cm的不透明墙壁组成的立方体箱。试验于上午7:30～ 12:00安静环境下进行。记录大鼠10 min内行程(水平运动)、后肢直立次数(垂直运动)，行为学得分=水平运动得分+垂直运动得分。每次实验彻底清洁旷场后再进行下一只大鼠的观察。

1.2.5ERK1/2、p-ERK1/2 mRNA表达水平的检测 各组大鼠腹腔注射给予20%乌拉坦(剂量5 mg/kg)麻醉，断头取脑，于冰面小心剥离脑组织，分离前额叶与海马，分别依次加入1 ml Trizol溶液，制作成组织匀浆。提取样品总RNA，检测浓度与纯度，逆转录成cDNA。每个样本中加入ERK1/2引物，同时进行PCR扩增，反应条件为95℃预变性5 min；95℃变性15 s，55℃退火32 s，72℃延伸32 s，重复40个循环；72℃延伸5 min，ERK1/2 mRNA 5′-CGTTCAGATGTCGGTGTC-3′；5′-AAAGGAGTCAAGAGTGGG-3′，β-actin 5′-GCCGGGAA-ATCGTGCGTGACATT-3′；5′GATGGAGTTGAAGGTAG-TTTCGTG-3′。

1.2.6ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白表达水平的检测 各组大鼠腹腔注射给予20%乌拉坦(剂量为5 mg/kg)麻醉，断头取脑，于冰面剥离脑组织，分离海马，冰浴下制成10%的组织匀浆，于4℃下3 000 r/min离心15 min，吸取上清液，按试验试剂盒说明书测定蛋白表达情况。

2 结果

2.1糖水消耗试验结果 给药前，模型组、银杏酮酯低、中、高浓度组大鼠蔗糖水摄入百分比显著低于对照组(P<0.05)。给药后，模型组大鼠蔗糖水摄入百分比显著低于对照组大鼠(P<0.05)；与模型组比较，银杏酮酯低、中、高浓度组大鼠蔗糖水摄入百分比显著升高(P<0.05)。给药后各组大鼠蔗糖水摄入百分比显著高于给药前(P<0.05)。见表1。

2.2大鼠旷场试验结果 给药前，模型组、银杏酮酯低、中、高浓度组大鼠旷场试验得分显著低于对照组(P<0.05)。给药后，模型组大鼠旷场试验得分显著低于对照组大鼠(P<0.05)；与模型组比较，银杏酮酯低、中、高浓度组大鼠旷场试验得分显著升高(P<0.05)。给药后各组大鼠旷场试验得分显著高于给药前(P<0.05)。见表2。

2.3ERK1/2、p-ERK1/2 mRNA表达水平测定结果模型组大鼠前额叶与海马p-ERK1/2 mRNA的表达水平显著低于对照组(P<0.05)，银杏酮酯低、中、高浓度组大鼠p-ERK1/2 mRNA的表达水平显著高于对照组(P<0.05)；各组间ERK1/2 mRNA的表达水平不存在显著差异(P>0.05)。见表3与图1。

GroupsnPercentage of sucrose water intakeBefore administrationAfter administrationControl1083.36±7.3282.95±5.66Model1058.72±4.311)60.56±7.321)50 mg/(kg·d)GBE1060.41±5.201)72.80±5.612)3)100 mg/(kg·d)GBE1060.38±7.621)75.52±6.402)3)200 mg/(kg·d)GBE1059.41±5.841)80.12±4.372)3)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05;compared with before administration,3)P<0.05.

GroupsBefore administrationAfter administrationControl90.80±3.6192.20±2.30Model21.00±1.241)20.90±2.601)50 mg/(kg·d)GBE22.10±3.421)39.00±4.922)3)100 mg/(kg·d)GBE20.60±2.161)60.00±2.712)3)200 mg/(kg·d)GBE21.40±2.781)79.90±6.152)3)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05;compared with before administration,3)P<0.05.

GroupsERK1/2 mRNAPrefrontal lobeHippocampusp-ERK1/2 mRNAPrefrontal lobeHippocampusControl0.445±0.0450.521±0.0700,614±0.0420.780±0.034Model0.420±0.0710.559±0.1040.240±0.0141)0.212±0.0461)50 mg/(kg·d)GBE0.442±0.0540.562±0.0620.521±0.0932)0.613±0.0412)100 mg/(kg·d)GBE0.449±0.0800.541±0.0780.550±0.1042)0.687±0.0722)200 mg/(kg·d)GBE0.453±0.0520.545±0.9070.603±0.0752)0.731±0.0442)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

GroupsERK1/2 proteinPrefrontal lobeHippocampusp-ERK1/2 proteinPrefrontal lobeHippocampusControl0.517±0.0980.553±0.0620.478±0.0560.581±0.073Model0.537±0.1040.572±0.0910.201±0.0341)0.248±0.0301)50 mg/(kg·d)GBE0.554±0.0870.558±0.0730.354±0.0732)0.448±0.0832)100 mg/(kg·d)GBE0.523±0.0720.569±0.1220.405±0.0982)0.537±0.0512)200 mg/(kg·d)GBE0.530±0.1310.544±0.1140.432±0.0732)0.552±0.0592)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

2.4ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白表达水平测定结果 模型组大鼠前额叶与海马p-ERK1/2 蛋白的表达水平显著低于对照组(P<0.05)，银杏酮酯低、中、高浓度组大鼠p-ERK1/2 蛋白的表达水平显著高于对照组(P<0.05)；各组间ERK1/2 蛋白的表达水平不存在显著差异(P>0.05)。见表4与图2。

图1 各组大鼠前额叶与海马的ERK1/2与p-ERK1/2 mRNA表达(Western blot)Fig.1 Expression of ERK1/2 and p-ERK1/2 protein in prefrontal and hippocampus lobe among each group(Western blot)Note:1.Control;2.Model;3.GBE low dose;4.GBE medium dose;5.GBE high dose.

图2 各组大鼠前额叶与海马ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表达(Western blot)Fig.2 Expression of ERK1/2 and p-ERK1/2 protein in perfrontal lobe and hippocampus among each group(Western blot)Note:1.Control;2.Model;3.GBE low dose;4.GBE medium dose;5.GBE high dose.

3 讨论

应激是心理疾病发生的促成因素，可引起机体内分泌失调以及神经化学变化，抑郁症的发生与应激密切相关[8]。本研究采用慢性轻度不可预见性应激联合孤养建立抑郁症动物模型，经过长期无规律的刺激，使大鼠处于心理紊乱状态。葡萄糖作为神经元的主要能力来源，当神经元细胞受到损伤，对葡萄糖的吸收减少，葡萄糖摄取量的减少降低了神经元细胞所需的能量，进一步加深了细胞损伤[9]。通过行为学评分表明，模型大鼠蔗糖摄入百分比、旷场试验得分均低于对照组大鼠，反映大鼠的兴趣与兴奋度减弱，与抑郁患者临床症状相符[10]，说明造模取得成功。

前额叶主要控制情绪变化和记忆学习能力，特别对快乐的获得功能。海马是调节情绪的重要脑区，也是应激损伤的主要易感部位，慢性应激主要通过HPA-Glu-NMDAR路径对其结构损害[11]。前额叶和海马区作为与记忆、学习等认知能力密切相关的脑区，在应激过程中最容易受到损害。前额叶与海马神经细胞信号转导通路异常，发生退行性变化，使得神经元细胞受损，容易引起抑郁发生[12]。因此，本研究选取前额叶与海马脑区观察ERK1/2的表达情况。银杏酮酯能够降低血清皮质酮浓度，抑制血清和海马炎症细胞因子的含量，具有缓解模型抑郁样行为的功效[13,14]。有研究表明，银杏酮酯对神经元有一定的保护作用[15]。ERK1/2大量存在于前额叶皮质和海马中，主要调节细胞的增殖和分化，磷酸化ERK1/2是其活化的形式。本研究结果表明，低、中、高剂量的银杏酮酯均可提高前额叶与海马的p-ERK1/2 mRNA和蛋白表达水平，说明银杏酮酯可以通过上调前额叶与海马ERK1/2磷酸化水平，对神经元细胞起到一定保护作用，缓解应激导致的抑郁样行为。