董庆园 马德清 杨 学 刘 勇 黄昌军 袁 诚 方敦煌 于海芹 童治军 沈俊儒 许银莲 罗美中 李永平 曾建敏,*

高抗黑胫病烤烟BAC文库的构建及分析

董庆园1,4,**马德清1,4,**杨 学2,**刘 勇1黄昌军1袁 诚1方敦煌1于海芹1童治军1沈俊儒3许银莲5罗美中2李永平1曾建敏1,*

1云南省烟草农业科学研究院, 云南昆明 650021;2华中农业大学生命科学技术学院, 湖北武汉 430070;3云南省烟草公司, 云南昆明 650011;4云南农业大学烟草学院, 云南昆明 650201;5云南省烟草公司临沧市公司, 云南临沧 677099

烟草是重要的模式植物。本研究利用pIndigoBAC536-S载体及d III限制性内切酶酶解烟草基因组DNA的方法, 构建了烟草新品系14-60的细菌人工染色体(BAC)文库。该文库共包含414,720个克隆, 保存在1080块384板中。随机挑选的120个烟草BAC克隆检测结果表明, 外源插入片段大小为97.0~145.5 kb, 平均约为123 kb, 空载率极低(0), 覆盖烟草基因组11倍。用烟草A基因、1基因、基因的特异引物进一步验证, 该文库质量高、可用性强, 为烟草黑胫病抗性基因的克隆以及其他重要农艺性状和品质性状等功能基因克隆研究提供了基础资源。

烟草; 基因组DNA; 细菌人工染色体(BAC); 基因筛选

普通烟草()是林烟草()和绒毛状烟草()杂交后自然加倍而成的异源四倍体植物[1-4]。研究表明, 烟草在生物制药[5-6]和生物燃料[7]方面的应用前景较大。烟草由于容易组织培养和遗传转化[8-9], 已被广泛应用于分子生物学研究, 是重要的模式植物。普通烟草基因组重复序列多、杂合度高, 已公布基因组序列。菲莫国际构建了林烟草(2.636 Gb)和绒毛状烟草(2.682 Gb)的参考基因组草图, 分别含有覆盖基因组82.9%和70.6%的遗传信息, 同时发现基因组内的重复序列比例高达72%~75%[10], 在烤烟品种K326和白肋烟品种TN90基因组中的重复序列也分别高达73.1%和78.9%[11], 且仅有19%的序列锚定到参考染色体组上。随着测序成本的降低, 烟草参考基因组的质量有了进一步的提高[12]。然而, 要想完全解释烟草基因组信息, 还需要进一步提高测序质量和组装、注释水平; 国内在这方面的研究有了一定的进步, 其中烤烟品种红花大金元的基因组组装质量较好, 但对烟草有利遗传性状资源的开发和利用速度有待进一步加强。

细菌人工染色体(BAC)文库是功能基因分离和基因组结构研究的重要工具, 在物理图谱构建、功能基因图位克隆、基因组全序列测定、比较基因组学分析等研究中发挥了重要作用, 特别是对未测序或基因组结构复杂的物种[13-16]。BAC文库已被广泛地应用于细菌[17]、动物[18]以及棉花[19]、水稻[20-21]、小麦[22]、玉米[23]、大豆[24]、番茄[25]、大麦[26]、高粱[27]、珍珠谷子[28]等物种的研究。构建烟草BAC文库的报道较少, 仅有烟草野生种绒毛状烟草[29], 栽培烟草品种Hicks Broadleaf[30]和SR1[31]。由于早期受到技术和成本限制, 很少开展高质量、大容量的BAC文库构建工作, 因此对这些BAC文库的具体参数、检测标准以及质量评价均没有做详细介绍。

烤烟是中国、津巴布韦、巴西、美国、加拿大、印度等国家主要经济作物之一。烤烟品种K326是全球主栽品种之一, 其烟叶品质深受广大卷烟工业企业认可, 同时也是现在烟草品种选育的重要亲本之一, 云烟87、云烟85、云烟97等多个大面积推广种植品种均与其有亲缘关系[32-34]。黑胫病是土壤传播的真菌病害, 是烟草生产最具毁灭性病害之一, 严重影响全世界烟叶生产安全[35-36]。育种家利用自然变异或诱导变异培育抗病新品种是解决黑胫病导致生产损失的最有效方法之一。目前, 烟草黑胫病抗源主要包括质量性状抗性和数量性状抗性2种类型。质量性状抗性基因有和, 分别来自于野生烟[37]和[38], 这2个抗源仅抗黑胫病0号小种、不抗1号小种, 随着大面积种植含有该抗源的烟草品种, 土壤中黑胫病1号小种有逐渐变为优势种群的趋势[39]。来自于黄花烟的Wz抗性基因, 高抗黑胫病0号和1号生理小种, 属于类似质量性状, 但抗性未达到免疫水平, 其对烟草产量和质量的影响小, 具有兼顾抗性和烟叶品质的特点[40-41]。

本研究获得了含有Wz抗性基因的K326近等基因系。通过构建该材料BAC文库, 不仅降低了对目的性状基因克隆的成本, 也弥补了对于已知烟草基因组缺少来自未测序烟草品种的遗传信息的不足, 为挖掘Wz抗性基因功能以及解析K326烟叶品质形成机制奠定重要基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以含有高抗烟草黑胫病抗性基因Wz的育种材料为供体亲本, 参照文献[42]报道的标记, 通过连续回交7代后再连续自交7代, 将该抗性基因导入我国主栽烤烟品种K326, 选取其中农艺性状表现优良的14-60作为该文库构建的材料。文库构建载体是pIndigoBAC536-S[43], 由华中农业大学基因组资源实验室构建。

1.2 试验方法

1.2.1 烟草基因组DNA Plug的制备 播种试验材料14-60, 四叶期收集嫩叶50 g, 冷冻保存于-80℃备用。关于高分子量烟草基因组DNA的制备方法和过程参照Luo等[44-45]。

1.2.2 烟草基因组DNA部分酶切条件的优化

参考文献的方法[46]优化烟草基因组DNA部分酶切条件。在相同时间内, 使用不同量的d III内切酶对相同量烟草基因组DNA进行酶切。实验设置内切酶浓度梯度为8个(0、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、10.0, 单位为U μL-1)。酶切反应体系包含H2O (25 μL)、10×buffer (10 μL)、40 mmol L-1亚精胺(10 μL)、5 μL不同浓度的内切酶和切碎的1/2 Plug (50 μL)。将反应体系置恒温37℃的水浴锅中, 反应15 min后置冰上, 每个体系中加入10 μL 0.5 mol L-1EDTA (pH 8.0), 静置15 min。通过脉冲场凝胶电泳检测酶解效果, 所用缓冲液为0.5×TBE, 参数设为14℃、1 s-50 s、120°、6 V cm-1、18 h。

1.2.3 大片段DNA筛选 参照刘家栋等[46-47]的方法进行2次大片段DNA筛选。采用优化后的酶解体系, 进行16个相同酶解反应, 在相同的脉冲场凝胶电泳条件下, 进行第１次DNA片段分离。电泳结束后, 在点样孔两侧向内各0.5 cm的地方, 将胶块切割成3份, 用EB (溴化乙锭)溶液对两边的胶块染色, 漂洗后, 放入凝胶成像仪进行成像分析, 用透明直尺作为参照。根据凝胶成像的结果, 从未染色胶块中间, 切下100~250 kb范围内宽约2 cm的胶条, 将切下的胶条平分成b胶条和a胶条(b>a)。将a胶条放在制胶模具的左边, b胶条放在右边, 倒入1%琼脂糖填满两块胶的周围, 之后将整块胶置凝胶电泳仪内, 继续进行第2次大片段DNA筛选。设凝胶电泳参数为120°、6 V cm-1、4 s-4 s、温度14℃, 时间18 h。第2次筛选结束后, 切下a、b胶条两侧的胶块, 染色、漂洗后, 进行凝胶成像。在a、b胶条上切下未染色大片段DNA的胶块, 并分别横切为a1、a2和b1、b2, 其中a1

1.2.4 BAC文库的构建 参照前人方法[44-47]构建烟草BAC文库。根据已知的λDNA浓度, 判断每个回收区段DNA的浓度, 只有回收区段DNA的浓度达到1 ng μL-1以上才进行连接反应。连接反应体系含有84 μL的大片段DNA、4 μL载体、2 μL T4 DNA连接酶, 以及10 μL T4 DNA连接酶buffer, 反应在16℃恒温水浴中进行16 h。反应结束后, 将连接体系置65℃干浴锅15 min。连接产物在脱盐胶(1%琼脂糖和2%葡萄糖)内脱盐1 h。将2 μL脱盐后的产物与18 μL大肠杆菌DH10B感受态细胞充分混合, 之后进行电转化, 将转化产物置500 μL SOC培养基中37℃复苏55 min。吸取复苏产物100 μL, 均匀涂布于LB固体培养基上, LB固体培养基含有氯霉素(12.5 mg L-1)、IPTG (100 mg L-1)、X-gal (80 mg L-1), 将培养皿倒置于恒温37℃培养箱内, 培养18 h。培养结束后, 随机从每个培养皿上挑取一定数量的白斑, 检测插入外源DNA片段的大小, 若达到目标, 则挑拣白斑至含有冰冻培养基的384孔板中、37℃培养, 并复制1份, 将培养好的细胞保存于-80℃冰箱中。

1.2.5 BAC文库的质量检测与基因筛选 参照前人方法[46], 随机从文库中挑取120个克隆, 在含有氯霉素(12.5 mg L-1)的LB液体培养基中培养过夜, 用碱裂解法提取质粒, 用I-I内切酶进行酶切、3.5 h, 通过脉冲场凝胶电泳, 检测外源DNA片段的大小、载体空载率等信息, 脉冲场凝胶电泳缓冲液为0.5×TBE, 电泳条件为5~15 s、120°、6 V cm-1、14℃、16 h。文库覆盖度依据烟草基因组大小、BAC文库总克隆数目、平均插入外源DNA片段大小和载体空载率计算。

从BAC文库中随机挑取40个克隆, 提取高纯度和浓度的质粒DNA, 进行BAC单末端测序(部分克隆进行双末端测序)。查询NCBI数据库中的烟草细胞器基因组数据库序列, 与末端序列(BES)比对, 估测该文库的细胞器污染率。

在NCBI数据库中, 查询烟草A基因(5¢-GG GATGCACTAGGATGGTCG-3¢, 5¢-AGCATAAGCCC GCAGTTTCT-3¢)、1基因(5¢-TGCATACGGTG GTCCAAACA-3¢,5¢-GCCTGAGGTTTGCTGAGAGT- 3¢)和基因(5¢-CGACATGTTTGTTCCGG TGG-3¢, 5¢-TGAGAGGTTCTCCGTCCAGT-3¢)的序列、设计相关引物, 对文库1080个一级混合池进行筛选并验证。

2 结果与分析

2.1 烟草基因组DNA Plug的制备与部分酶切

制备烟草细胞核DNA时, 在NIB溶液中加入0.15% β-巯基乙醇与4% PVP-40, 防止烟草基因组DNA氧化降解。加入1% Triton裂解烟草细胞器膜, 避免细胞器DNA的污染。用蛋白酶K溶解液处理消化烟草细胞核膜, 释放出烟草基因组DNA, 共得到烟草高分子量DNA包埋块36块。

从图1可看出, 未加d III酶的泳道, DNA拖带亮度低, 证明提取过程中损伤低、提取的DNA质量好, 满足BAC文库构建要求。d III酶浓度梯度的酶切效果差异显著, 其中1.0 U μL-1的d III酶浓度的效果最好(图1)。

2.2 烟草基因组大片段DNA筛选

根据预先部分酶切的结果, 选择了1.0 U μL-1的d III酶浓度和14 min酶切时间进行大量酶切, 随后进行酶切产物的第1次和第2次筛选。图2为烟草基因组大片段DNA第1次筛选结果。参照荧光尺刻度, 切下未经EB染色5.4~6.4 cm范围内的、6.4~7.4 cm范围内的b片段胶块, 得到100~250 kb的烟草基因组DNA片段。

图1 烟草plug DNA部分酶切

图中第1泳道为λ ladder PFG Marker, 2~9泳道分别为半块plug的酶切条带。酶浓度依次为0、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、10.0 U μL-1。酶切时间为15 min。

The first lane is the λ ladder PFG marker, lanes 2–9 are enzyme digested bands of half plug. The order of enzyme concentration is 0, 0.3, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 4.0, and 10.0 U μL-1. The enzyme digestion time is 15 min.

图2 烟草基因组DNA的第1次筛选

1%琼脂糖胶脉冲场电泳条件为0.5×TBE, 1 s-50 s, 120°, 6 V cm-1, 14℃, 18 h。Marker为λ ladder PFG。

DNA was separated on 1% CHEF agarose gel at 1 s-50 s linear ramp, 6 V cm-1, 14℃ in 0.5×TBE buffer for 18 h. The marker is λ ladder PFG marker.

图3显示, 第1次筛选得到b片段胶块中几乎不含小片段DNA; 而a片段中则含有较多的小片段, 经过第2次脉冲场凝胶电泳分离, 胶块中DNA小片段的浓度明细降低。依据透明直尺参照的位置, 将2个未染色片段DNA分别切成2份, 每份胶块0.5 cm左右, 其中a片段从7.5~8.5 cm范围切下, 得到a1、a2 (a1

图3 烟草基因组DNA的第2次筛选

1%琼脂糖胶脉冲场电泳条件为0.5×TBE, 14℃, 18 h, 4 s-4 s, 120°, 6 V cm-1。

DNA fragments were separated on 1% CHEF agarose gel at 4 s-4 s linear ramp, 6 V cm-1, 14℃ in 0.5×TBE buffer for 18 h. The marker used is λ ladder PFG marker.

2.3 BAC文库构建及检测

从图4可以看出, a1的浓度最低, 在1 ng μL–1左右, a2、b1、b2的浓度都在2~3 ng μL-1之间, 满足与载体连接要求。

根据预转化后的结果进行连接产物大量转化,最终获得414,720个克隆(表1), 保存在1080块384孔板中。对随机挑选的120个克隆进行了分析, 其中部分BAC克隆平均插入片段检测结果见图5。如λ ladder PFG Marker所示, 烟草BAC文库随机插入片段的大小在97.0~145.5 kb范围, 平均约为123 kb, 空载率为0。对40个BAC克隆进行了末端序列测定, 测序结果显示没有烟草细胞器和细菌DNA序列污染。按烟草基因组4500 Mb计算, 该文库覆盖度约为11倍基因组。

图4 洗脱产物DNA的浓度检测

λDNA标准液1 μL, 浓度分别为1、2、3、4 ng μL-1; a1、a2、b1、b2电洗脱产物各1 μL。

The loading volumes for the recovered DNA fractions a1, a2, b1, b2, and the standard λDNA solutions of 1, 2, 3, 4 ng μL-1are 1 μL each.

表1 烟草BAC文库统计分析

图5 烟草BAC文库随机克隆的插入片段检测(部分)

为部分随机挑选的40个克隆的插入片段检测图片。Marker为λ ladder PFG。

It is the insert detection image of 40 randomly selected clones. Marker is λ ladder PFG.

2.4 烟草BAC文库基因筛选

为验证文库的可用性, 利用PCR对3个基因进行了筛选。从图6可以看出,A基因引物的扩增条带约460 bp, 在烟草BAC文库一级混合池共筛选到26个阳性克隆。测序结果表明, 这26个克隆的序列与NCBI中A基因序列结果一致。另外,1基因共筛选到11个阳性克隆(图7),基因共筛选到13个阳性克隆(图8), 表明所构建的烟草BAC文库覆盖度达到理论覆盖度11倍以上, 质量可靠。

3 讨论

大片段基因组DNA是制备BAC文库前提, 然而大片段DNA容易降解。因此, 本BAC文库构建过程中提取HMW DNA时, 所有操作尽量保持在卫生干净、低温环境下, 避免因为空气或者灰尘中的微生物等外界因素污染文库的构建质量。基因组DNA浓度低, 获得大片段DNA的机会也低, 但浓度过高的基因组DNA在脉冲场中很难完全分离, 无法通过PFGE分开, 大、小片段的DNA容易堆积在一起[44-45]。此外, DNA浓度太高还会增加包埋块的粘稠度, 使限制性内切酶与基因组DNA无法均匀混合,酶切的效果差。本文库构建选用的DNA浓度合适(图1), 为成功构建烟草BAC文库奠定重要基础。

图6 一级混合池2号板132~166编号的PCR筛选结果(hemA)

Marker为Trans2K DNA marker, 从上到下依次是2000、1000、50、500、250、100 bp。

The marker is Trans2K DNA marker, and the bands from top to bottom represent 2000, 1000, 750, 500, 250, and 100 bp.

图7 一级混合池2号板161~190编号的PCR筛选结果(eIF4E-1)

Marker为Trans2K DNA marker, 从上到下依次是2000、1000、750、500、250、100 bp。

The marker is Trans2K DNA marker, and the bands from top to bottom represent 2000, 1000, 750, 500, 250, and 100 bp.

图8 一级混合池9号板898~927编号PCR筛选结果(NtFT)

Marker为Trans2K DNA marker, 从上到下依次是2000、1000、750、500、250、100 bp。

The Marker is Trans2K DNA marker, and the bands from top to bottom represent 2000, 1000, 750, 500, 250, and 100 bp.

外源DNA片段大, 与载体连接的产物转化效率低; 外源DNA片段小, 与载体相连产物转化却很容易。因此, 筛选合适的DNA片段也是构建BAC文库的重要步骤。本研究通过2次筛选, 获得了随机插入片段大小在97.0~145.5 kb范围(图2和图3), 平均插入片段为123 kb (图5)。通过优化限制性内切酶d III的用量及反应时间, 实现对烟草基因组DNA的随机酶切, 控制了高分子量大小片段均一插入, 效果和文献报道接近[48-49]。本研究通过随机检测120个烟草BAC克隆, 发现本文库的空载率为0 (图5)。有研究结果表明, 如果内切酶的用量过大, 将产生非特异性的酶切, 产生假阳性比例高, 文库的空载率也高[50], 严重影响文库的质量。

用于构建烟草BAC文库的克隆载体由华中农业大学基因组资源实验室构建, 通过酶切, 除去复合载体pHZAUBAC1高拷贝复制子后, 获得克隆载体pIndigoBAC536-S。利用pIndigoBAC536-S克隆载体上I-I释放完整插入片段的特点, 当电泳泳道出现2条大小相近条带时, 可判断为双克隆, 极大改善了BAC文库的构建分析和评价等工作。pHZAUBAC1复合载体已经被成功应用于众多BAC文库的构建[47,51]。

BAC文库基因筛选方法, 包括Southern杂交法、高密度影印膜(HDR)菌落杂交筛选法、PCR筛选法[51]。前两方法均需要将BAC克隆转移在尼龙膜上, 再使用探针筛选克隆, 过程复杂、工作量大, 而PCR筛选方法与前两者相比具有操作简单, 成本低的优点, 应用范围广。早花基因()能够有效缩短烟草开花时间, 该技术成功应用于烟草育种[11,52]。研究表明va基因型烟草植株的抗性是由于对PVY感病的基因片段的缺失造成的[53], 即-1基因, 属于真核生物翻译起始因子(eucaryotic initiation factor, 简写为eIF)的一种类型[54]。5-氨基乙酰丙酸(ALA)的合成是植物体内四吡咯生物合成的限速步骤, 谷氨酰t-RNA还原酶基因(A)是控制ALA合成最关键酶[55]。本研究采用烟草A基因、1基因、基因的特异引物对构建的文库进行筛选验证, 结果表明这3个基因的文库覆盖度高达11~26倍, 可见, 所构建文库的质量比预期还好。

种植不同类型抗性品种是解决该病害的重要途径。然而关于Wz抗性位点的遗传信息非常有限, 全面解释其基因功能和结构是利用该抗性的重要基础。本研究构建的BAC文库一共有414,720个克隆, 保存在1080个384孔板中, 平均插入片段约123 kb, 覆盖烟草基因组11倍, 文库的插入片段较大, 均一性较好, 叶绿体和线粒体DNA污染率低、空载率低。虽然烟草的参考基因组序列已经发表, 但是其参考基因组序列的质量仍然有待提升。由于Wz抗性基因来自黄花烟, 属于另一个烟草种, 与现有测序的烟草品种存在种间差异, 已知的参考基因组中并未包含本研究中导入的Wz抗性基因的相关信息, 因此完全依赖参考基因组无法进行Wz抗性基因的克隆。此外, 该BAC文库是以K326为背景构建的, 因此可以作为现有烟草基因组在组装和注释等方面存在的问题的一个重要参考, 为解析K326其他优良性状提供基础资源。终上所述, 本研究构建的烟草BAC文库能够很好地覆盖烟草的基因组信息, 可以作为提升和完善烟草基因组序列的重要资源, 包括部分基因组信息无法锚定到具体染色体位置, 同时为解决现有烟草基因组中缺少来自黄花烟抗性基因Wz的遗传信息提供最直接的补充, 也为挖掘Wz抗性基因功能, 解析K326烟叶品质形成机理以及烟草数量性状相关功能基因的克隆提供基础材料。

4 结论

本研究构建的高抗黑胫病烤烟BAC文库含有414,720个克隆, 保存在1080个384孔板中, 外源插入片段大小在97.0 kb至145.5 kb间、平均约为123 kb, 覆盖普通烟草基因组11倍。文库的插入片段较大, 均一性较好, 叶绿体和线粒体DNA污染率低、空载率低。为抗性基因定位克隆和功能挖掘, 解析K326烟叶品质形成机制提供基础材料。

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Construction and characterization of a BAC library for flue-cured tobacco line with high resistance to blank shank

DONG Qing-Yuan1,4,**, MA De-Qing1,4,**, YANG Xue2,**, LIU Yong1, HUANG Chang-Jun1, YUAN Cheng1, FANG Dun-Huang1, YU Hai-Qin1, TONG Zhi-Jun1, SHEN Jun-Ru3, XU Yin-Lian5, LUO Mei-Zhong2, LI Yong-Ping1, and ZENG Jian-Min1,*

1Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Kunming 650021, Yunnan, China;2College of Life Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China;3Yunnan Province Tobacco Company,Kunming 650021, Yunnan, China;4College of Tobacco Science, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, Yunnan, China ;5Lincang City Company of Yunnan Tobacco Company, Lincang 677099, Yunnan, China

Tobacco () is an important model crop in molecular biology research. In this study, a bacterial artificial chromosome (BAC) library of a flue-cured tobacco line 14–60 with high blank shank resistance and good quality was constructed. High molecular weight DNA was isolated using intact nuclei from tobacco, partially cleaved withd III and cloned into the pIndigoBAC536-S vector. The BAC library consisted of 414,720 clones arrayed in one thousand and eighty 384-microtite plates, with an average insert size of 123 kb ranging from 97.0–145.5 kb. No empty insert clone was found. Based on an estimated genome size of 4500 Mb for common tobacco, the BAC library was estimated to cover 11 times of genome equivalents. The utility of the library was further confirmed by screening the library with the primers of tobaccoA,, and1 genes. The high capacity library will serve as a giant genomic resource for map-based cloning of quantitative trait loci or genes associated with important agronomic and smoking quality traits or resistance to blank shank, physical mapping and comparative genome analysis.

tobacco; genomic DNA; bacterial artificial chromosome (BAC); gene screening

10.3724/SP.J.1006.2020.94110

本研究由中国烟草总公司云南省公司科技项目(2017YN04, 2019530000241004)资助。

This study was supported by the Grants of Yunnan Province Tobacco Company (2017YN04, 2019530000241004).

曾建敏, E-mail: zengjm2017@163.com

**同等贡献(Contributed equally to this work)

董庆园, E-mail: BlueSkies183@163.com, 马德清, E-mail: 1847494695@qq.com, 杨学, E-mail: 919231424@qq.com

2019-07-29;

2020-01-15;

2020-01-24.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200123.2202.014.html