谢玉清，代金平，陈 竞，王志方，古丽努尔·艾合买提，杨新平，张慧涛，王小武，冯 蕾

(新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物重点实验室，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】漆酶最早于1883 年在漆树的汁液中发现研究表明漆酶广泛存在于自然界中，如植物、真菌、细菌、动物及昆虫中[1]。漆酶属于蓝色氧化酶家族，是一种含铜的多酚氧化酶，以分子氧作为最终电子受体，是重要的木质纤维降解酶之一，还能催化降解多种芳香族化合物特别是酚类，因而漆酶作为一种绿色生物催化剂在生物质能源、纸浆生物漂白、染料脱色、废水处理、食品加工等领域具有广阔的应用前景[2]。真菌漆酶比细菌漆酶、植物漆酶等具有更好的热稳定性、金属离子耐受性及更高的底物催化氧化性，在工农业及环境领域的应用中得到了较高的关注[3]。大型真菌无柄灵芝菌(G.resinaceum)是漆酶最主要的生产者。真菌漆酶的生产模式包括固态发酵和液体发酵，工业生产基本以液体发酵为主，而高产酶发酵培养基的筛选和优化是工业化生产漆酶的关键。漆酶在食品、能源和环保等领域具有重要的应用价值。无柄灵芝菌可以合成分泌包括漆酶在内的多种木质纤维素降解酶，这些酶活性随着发酵工艺不同而不同，对产酶发酵工艺关键影响因素培养基进行筛选优化，对于提高漆酶产量和酶活具有重要意义。【前人研究进展】 陈建军等[4]对产漆酶黄孢原毛平革菌培养基进行筛选优化，确定乳糖和酵母粉为最佳碳、氮源，使该菌的产酶能力提高了4.7倍。柴新义等[5]采用20 g/L 蔗糖，2 g/L 酵母膏，3.2 g/L K2HPO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O， 3 mg/L SDS，6 mmol/L Cu2+，pH7.0的优化培养基，使有柄树舌灵芝菌产漆酶活性达到496.18 U/mL，是优化前的12.2倍。【本研究切入点】培养基是发酵工艺优化中的首要条件，试验在基础产酶培养基和单因素试验的基础上，对无柄灵芝菌(G.resinaceum)LZ02产酶培养基的碳、氮源进行了进一步的筛选，利用响应面法优化最佳的产漆酶培养基组合。【拟解决的关键问题】研究采用响应面法对大型真菌无柄灵芝菌(G.resinaceum)LZ02的产漆酶的液体发酵培养基进行优化研究，并对优化所得的理论最佳条件进行试验验证，筛选出高产漆酶的液体培养基配方。获得高产漆酶的液体发酵培养基的碳、氮源配比，为真菌漆酶的规模化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌种

无柄灵芝菌(G.resinaceum)LZ02为实验室保存菌株。

1.1.2 培养基

产酶基础培养基MF[6-8]：麦麸25 g，葡萄糖10 g，酒石酸铵1.84 g，NaCl 1.0 g、KH2PO42 g，琥珀酸钠1.18 g， VB110 mg，聚山梨酯-80 0.5 g，微量元素溶液70 mL，加水定容至1 000 mL， pH 调至5.5。

微量元素组成：MgSO4·7H2O 3.0 g、MnSO4·H2O 0.5 g、ZnSO4·7H2O 0.1 g、CuSO4·7H2O 0.1 g、CaCl2·2H2O 0.1 g、KAl(SO4)2·12H2O 10 mg、H3BO310 mg、NaMnO4·2H2O 10 mg，加水定容至1 000 mL。

1.1.3 酶检测试剂

0.1 mol/L NaAc-HAc缓冲液(pH 4.0)，0.5 mmol/L 2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)，漆酶(Laccases)。

1.2 方 法

1.2.1 漆酶活力测定

采用ABTS[2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)]法。反应体系组成为0.1 mol/L NaAc-HAc缓冲液(pH 4.0) 1.95 mL、0.5 mmol/L 连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS) 2.00 mL和适当稀释的酶液50 μL， 28℃启动反应。并在3 min内连续测定反应液420 nm(ε=3.6×104cm-1mol-1L)处吸光值的增加值。该条件下，每分钟使1 μmol/L ABTS氧化所需的酶量定义为1个活力单位(U)。

漆酶活力计算公式：漆酶活力(U/L)=(n×△A×106×V1)/(3.6×104×3×V2).

其中：n为酶液稀释倍数；V1为反应总体积；V2为反应酶液体积；△A为3 min内反应液在420 nm处吸光度的变化值； 3.6×104为ABTS氧化态的摩尔吸光系数(cm-1mol-1L)。

1.2.2 液体培养基的响应面法优化

在MF基础产酶培养基和单因素试验基础上，各选择两种最优的碳、氮源进行组合。根据Design-Exper 8 软件的中心组合设计方法，设计干酪素、麦麸、葡萄糖、酒石酸铵四个因素设计响应面试验。对生成的响应面三维曲面图以及等高线图数据进行分析，根据建立的数学模型，得到优化后的高产漆酶液体培养基。表1

应用 Design-Exper8 软件的中心组合设计方法[9-11]，进行干酪素(A)、麦麸(B)、葡萄糖(C)、酒石酸铵(D)四因素三水平的响应面试验设计，共设计出 29 个组合，共有5组中心试验组，分别是9、16、18，21和29，其余均为非中心试验组。中心试验组重复5次，用以估计试验误差。

表1 响应面分析因素水平Table 1 Factors and levels in response surface design

2 结果与分析

2.1 响应面设计

研究表明,漆酶产量(Y)对四个因素的二次多项回归方程为：

Y=-29 167.937 50+1 692.500 00A+11 089.958 33B+13 592.083 33C+376 15.520 83D+3 170.750 00AB-2 089.000 00BC-5 443.12 500BD-1 011.0416 7A2-2 607.791 67B2-2 671.666 67C2-222 18.229 17D2。表2

研究表明，模型P值(P<0.000 1)<0.01极显著，失拟误差(0.089 7)>0.05不显著，即该模型在被研究的整个回归区域内拟合性较好，该模型比较可靠，能够对发酵漆酶活性条件进行预测。模型中，一次项D显著，A极显著，干酪素、酒石酸铵对无柄灵芝菌(G.resinaceum)LZ02产漆酶均具有显著影响，各因素影响顺序分别为干酪素>酒石酸铵>麦麸>葡萄糖。表3

表3 回归模型的方差Table 3 Variance analysis results of regression model

注：P<0.01，极显著(**)；P<0.05，显著(*)
Note:P<0.01，extremely significant(**)；P<0.05 significant(*)

图1 麦麸和洒石酸铵交互作用下漆酶产量的等高线和响应面
Fig.1 Interaction effect of wheat bran and ammonium tartrate on the contour and response surface diagram of laccase yield

2.2 响应面分析

研究表明,响应值与各参数之间相互作用产生的影响。若弯曲程度大，则表明该因素对漆酶产量的影响越大，相应表现为响应值变化的大小。通过软件 Design-Expert 8分析，确定最佳培养基为干酪素含量2.5%、麦麸含量1.5%、葡萄糖含量1.0%和酒石酸铵含量0.6%时，相应响应面二次模型预测漆酶活性最大值为16 505U/L。

通过3次平行试验得到的LZ02菌漆酶活性为15800 U/L，与理论预测值无明显差异，响应面分析法提供的模型较真实地拟合了实际情况，证明了模型的可靠性。 图1～4

图2 葡萄糖和麦麸交互作用下漆酶产量的等高线和响应面
Fig.2 Interaction effect of glucose and wheat bran on the contour and response surface diagram of laccase yield

图3 葡萄糖和酒石酸铵交互作用下漆酶产量的等高线和响应面
Fig.3 Interaction effect of glucose and ammonium tartrate on the contour and response surface diagram of laccase yield

图4 干酪素和酒石酸铵交互作用对漆酶产量的等高线和响应面
Fig.4 Interaction effect of casein and ammonium tartrate on the contour and response surface diagram of laccase yield

3 讨 论

漆酶是一种分布广泛的多酚氧化酶，在食品、能源和环保等领域具有重要的应用价值.灵芝菌可以合成分泌包括漆酶在内的多种木质纤维素降解酶，这些酶的活性会随着发酵工艺的不同而不同，对产酶发酵工艺进行优化，对于提高漆酶产量和酶活具有重要意义[12-14]。

响应面法是一种综合试验设计和数学建模的优化方法，可以节约试验成本，缩短工作时间达到对实验因素的全面衡量，并可分析各因素之间的交互影响。实验在单因素的基础上从多个因素中筛选出主要因素，减少优化试验次数及工作效率[15]。

4 结 论

培养基是发酵工艺优化中的首要条件，试验在基础产酶培养基的基础上，对无柄灵芝菌(G.resinaceum)LZ02碳氮源进行了进一步的筛选，并利用响应面法优化最佳的产漆酶培养基组为：干酪素2.5%、麦麸1.5%、葡萄糖1.0%和酒石酸铵0.6%，优化之后漆酶活性达到15800 U/L，通过试验结果验证，验证了该预测值的准确性和可靠性。。