钱红梅，郭俊佩，刘小琼，欧阳春平，高建华

（山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801）

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是革兰氏阳性菌，能够在不同的生长时期产生不同种类的杀虫蛋白。比如，对数生长中期可以分泌外毒素，其被称为营养期杀虫蛋白（Vegetative insecticidal proteins，VIPs）[1]；芽孢形成的时候会产生杀虫晶体蛋白（Insecticidal cystal proteins，ICPs）[2]。其中，研究最早，最广泛的是杀虫晶体蛋白，其可分为Cry（Crystal protein，晶体毒素）和Cyt（Cytolitic protein，细胞裂解素）两大类。Bt 杀虫蛋白的广谱性，使其成为农业研究和生产中关注的热点。

从第一个cry 基因cry1Aa1[3]被克隆之后，Cry 蛋白被相继发现[4]。为便于对众多Cry 蛋白进行归类和研究，人们建立了Cry 蛋白分类和命名的规则[3]。Cry 蛋白的表达模式、基本空间结构和杀虫机制等均已被深入研究[5-9]。目前，多种Cry 蛋白已被成功用于转基因抗虫作物，例如Cry1A 蛋白在棉花中表达，可有效地减少棉铃虫的侵害[10]；Cry1Ac 和Cry1C蛋白在花椰菜中同时表达，可使花椰菜中小菜蛾的抗性推迟[11]；在棉花中表达Cry2Ab 蛋白，能够使棉铃虫停止摄食，从而饥饿至死[12]；Cry1Ia 蛋白能够毒害鳞翅目和鞘翅目的昆虫[13]；同时，Cry1Ia 也是少有的能够在大肠杆菌中可溶性表达的Cry 蛋白[14]。因此，不断筛选新的Cry 蛋白能够为农业生产提供更多的抗虫资源。

Cry1B 是Cry1 类蛋白的一个分支，其分子质量大小约为140 ku，与传统的Cry 蛋白一样都具有3个经典结构域，且这3 个结构域与杀虫活性密切相关[5-9]。通过结构域的交换获得新的杀虫谱或改变杀虫活性，是Cry 蛋白常见的改造方式[15]。目前，已知的Cry1B 蛋白有10 个亚类，分别是Cry1Ba、Cry1Bb、Cry1Bc、Cry1Bd、Cry1Be、Cry1Bf、Cry1Bg、Cry1Bh、Cry1Bi 和Cry1Bj[4]。

本研究以山西农业大学杂粮分子育种团队前期筛选并克隆的一个新的cry1Bd 基因（命名为new-cry1Bd）为研究对象，首先分析了该基因编码蛋白new-Cry1Bd 与Cry1B 系列蛋白的亲缘关系，然后将cry1Bd 基因克隆至pHT304 质粒，并检测其蛋白表达；另外，将new-Cry1Bd蛋白N 端部分进行独立表达，检测其表达稳定性，旨在为后续研究和利用该杀虫蛋白奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

供试菌株为大肠杆菌（Escherichia coli）TG1 菌株和苏云金芽孢杆菌BMB171 菌株。

试剂为TaKaRa primeSTARRHS DNA Polymerase with GC Buffer（货号R044A）试剂盒；南京诺唯赞生物科技有限公司重组试剂盒ClonExpressRII One Step Cloning Kit（货号c112-02）；中科瑞泰的1 kb Plus DNA ladder（货号RTM418）；AxyGEN 质粒小提试剂盒（货号AP-MN-P-250G）和DNA 回收试剂盒（货号AP-GX-50G）；Thermo 的限制性内切酶BamHI、SacI、KpnI、EcoRI 和蛋白质标准分子量PageRuler Prestained Protein Ladder。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 氨基酸多序列比对构建进化树 从NCBI 网站上下载Cry1B 蛋白家族中12 个蛋白（Cry1Ba、Cry1Bb、Cry1Bc、Cry1Be、Cry1Bf、Cry1Bg、Cry1Bh、Cry1Bi 和Cry1Bj 以及3 种Cry1Bd 蛋白）的氨基酸序列，使用Mega X 将new-Cry1Bd 蛋白序列与这12 个蛋白的氨基酸序列进行聚类分析（Neighbor joining 法）[16-17]。

1.2.2 表达载体的构建 首先，用BamHI 和SacI双酶切p304-2Ab-1I 质粒[18]，用DNA 回收试剂盒回收相应载体片段。以新分离鉴定的new-cry1Bd基因作模板，用引物1Ball-CDS-R（5′- ACCTGAGT TTGCCTCGAGCTCCTATTCTTCCATGAGGAATAGT TC-3′）和1B-CDS-F（5′-TAAAAGAGATGGAGGG GATCCACCATGACTTCAAATAGGAAAAATG-3′）进行PCR 扩增，获得相应的目的基因；然后通过重组克隆将目的基因克隆至上述线性化载体中，并转化大肠杆菌TG1 菌株；通过酶切鉴定，将正确的质粒命名为p304-new-cry1Bd，含有该质粒的大肠杆菌命名为T304-new-cry1Bd；以p304-new-cry1Bd 为模板，用引物1B-CDS-F（5′-TAAAAGAGATGGAGGG GATCCACCATGACTTCAAATAGGAAAAATG-3′）和1-half-R-new（5′-TAAACCTGAGTTTGCCTCGAGC TCTTATAAGTTTCTTTCATCACTGA-3′）扩增Cry1Bd蛋白N 端编码序列，并用相同的方法克隆至上述线性化的p304-2Ab-1I 载体中，将该质粒命名为p304-new-cry1Bdhalf，含有该质粒的大肠杆菌命名为T304-new-cry1Bdhalf。

1.2.3 2 种蛋白的表达与可溶性分析 将成功构建的2 个表达载体和pHT304 质粒，用电击法分别转入苏云金芽孢杆菌BMB171 感受态细胞[19-20]；用涂布平板法平铺到含有25 μg/mL 红霉素的固体LB培养基上，28.5 ℃过夜培养；分别将这3 个菌株的单克隆接种于3 mL 液体LB 培养基（含有25 μg/mL的红霉素），28.5 ℃过夜培养72 h。每个试管各取2 mL 菌液，12 000 r/min 离心10 min，分离上清和沉淀。向沉淀中加入800 μL Na2CO3溶液（50 mmol/L Na2CO3，10 mmol/L DTT，pH 值为10.5），放入37 ℃恒温摇床，200 r/min 振荡1 h；然后12 000 r/min 4 ℃离心20 min，分离上清和沉淀。所有上清用3 ku 的超滤管超滤至160 μL。沉淀用160 μLPBS（137 mmol/L的NaCl、2.7 mmol/L的KCl、10 mmol/L 的Na2HPO4、2 mmol/L的KH2PO4，pH 值7.4）重悬。所有样品中，加40 μL 的5×Protein loading buffer，沸煮10 min；然后，12 000 r/min 离心5 min，上样，进行SDS-PAGE电泳，并分析蛋白表达及可溶性。

2 结果与分析

2.1 new-Cry1Bd 蛋白亲缘关系分析

将new-Cry1Bd 蛋白与12 种Cry1B 蛋白进行亲缘关系分析，结果发现（图1），new-Cry1Bd 蛋白与Cry1Bd 蛋白更接近，将该蛋白与Cry1Bd1 进行氨基酸序列比对，结果发现有3 处差异（图2），即Cry1Bd1 蛋白第572 位为丝氨酸（S），而new-Cry1Bd中变成亮氨酸（L）；第1 147 位氨基酸由谷氨酸（E）变成天冬氨酸（D）；第1 227 位氨基酸由亮氨酸（L）变成苯丙氨酸（F）。其中，L572 位于Cry1B 蛋白的结构域III（Domain III），另外2 个差异位点位于其C 端尾部，推测对其杀虫活性影响不大。

2.2 载体的构建及鉴定

将new-Cry1Bd 蛋白的编码序列接入pHT304载体，并置于cry1Ac 基因的启动子（Pac）和终止子（Tac）调控之下（图3-A）。同时，为了研究该蛋白N端的表达稳定性，将其编码序列也接入pHT304 载体，并由Pac和Tac调控其表达。对这2 个质粒进行限制性内切酶酶切鉴定，结果显示，产物图谱与预期一致（图3-B）。

2.3 2 个蛋白的表达和可溶性分析

将含有p304-new-cry1Bd 或p304-new-cry1Bdhalf 的Bt 菌株培养72 h 后，检测其蛋白表达情况，同时对其表达产物的可溶性进行分析，结果显示（图4），new-Cry1Bd 和new-Cry1Bdhalf 蛋白均能表达，且其大小均与预期一致，分别为139.7、80.8 ku。

对new-Cry1Bd 和new-Cry1Bdhalf 这2 种蛋白的表达产物进行可溶性试验，结果显示，2 种蛋白的表达产物均能部分溶解于碱性Na2CO3溶液，其中，完整的new-Cry1Bd 溶解比例高于new-Cry1Bdhalf。

3 结论与讨论

前期，我们筛选了8 种新型cry1B 基因[21]。本研究又获得一种新的Cry1B 蛋白（new-Cry1Bd），通过将其与其他Cry1B 家族代表比较亲缘关系，结果发现，该蛋白与Cry1Bd 蛋白最为相似。将该蛋白氨基酸序列与3 种Cry1Bd 分支进行深入比对，结果发现，相比Cry1Bd1 蛋白，new-Cry1Bd 蛋白仅有3 个差异氨基酸。其中，1 个位于N 端结构域III 区域（L572），另外2 个位于C 端尾部（D1147 和F1227）。其中，位于N 端结构域III 的差异氨基酸L572，在其他已知的3 种Cry1Bd 蛋白中相对保守，均为丝氨酸，但这2 种氨基酸性质差异较大，因此，可能对该蛋白的活性或稳定性产生一定的影响；位于C 端的2 个差异位点在3 种已知的Cry1Bd 蛋白中也较为保守，但是由于C 端不参与Cry 蛋白杀虫活性[4-8]，因此，推测这2 处的氨基酸差异与new-Cry1Bd 杀虫活性无关。

为了进一步研究new-Cry1Bd 蛋白的杀虫活性和应用潜力，本研究构建了该蛋白及其N 端编码序列（Cry1Bdhalf）的表达载体，并将这2 种载体分别转化Bt 菌株进行目的蛋白的表达，结果显示，不论完整的new-Cry1Bd 还是其N 端多肽，均能够在Bt细胞中表达，但这2 种表达产物的可溶性差异较大，约1/2 左右的new-Cry1Bd 蛋白可以溶于碱性Na2CO3溶液，而仅有很少比例的new-Cry1Bdhalf 可以溶解。结果说明，Cry1Bd 蛋白的C 端对其表达产物的结构具有较大的影响，这与其他Cry 蛋白一致[3，5]。

综上所述，本研究报道了一种新型的Cry1Bd蛋白，该蛋白与Cry1Bd1 的亲缘关系最近，仅有3 个氨基酸差异。该蛋白的发现为Cry1Bd 分支增添了新成员，更为重要的是，new-Cry1Bd 在其执行杀虫活性的N 端部分仅1 个氨基酸差异。因此，该蛋白也可以直接作为1 个点突变体研究Cry1Bd 系列蛋白的杀虫机制。