冶俊玲 苟笑丹 韩静绮 郭新建 王丰梅 (青海大学附属医院病理科，青海 西宁 810001)

脑源性神经营养因子(BDNF) 是神经生长因子家族的主要成员之一，对神经元的生长，分化起着至关重要的作用〔1〕。但研究发现BDNF与酪氨酸蛋白激酶受体(Trk)B结合导致TrkB磷酸化从而激活细胞内的丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)和磷脂酶(PL)C等多条信号通路来参与肿瘤细胞的增殖、凋亡及侵袭转移〔2,3〕。有研究显示在肝癌、胰腺癌、卵巢癌等肿瘤中BDNF和TrkB呈高表达，并且与疾病的发生发展及预后关系紧密，因此BDNF/TrkB可能作为肿瘤的生物治疗的靶点〔4,5〕。但是国内外关于BDNF和TrkB在食管癌中的表达，参与食管癌侵袭转移相关的研究报道较少。因此本研究分别在食管癌组织中检测BDNF、TrkB蛋白的表达，并检测它们在食管癌细胞中的mRNA水平，分析两者的表达与患者的临床病理特征之间的联系，同时观察外源性BDNF对食管癌TE-1细胞增殖与侵袭的影响，探讨BDNF和TrkB在食管癌发生、发展中的作用，为临床上食管癌的治疗提供新的方向。

1 材料与方法

1.1材料 人食管癌细胞株ECA109、TE-1和正常食管永生化上皮细胞株HET-1A均购置于南京凯基生物。BDNF鼠抗人单克隆抗体、TrkB兔抗人多克隆抗体、辣根酶过氧化物标记的二抗购自美国Santa Cruz公司，外源性人重组BDNF蛋白购自美国Peprotech公司，由Invitrogen公司提供Trizol Reagent，MBI Fermentas公司提供逆转录试剂盒和cDNA扩增试剂盒，CCK8试剂盒购自南京凯基生物有限公司，Transwell小室购自美国corning公司。

1.2方法

1.2.1组织标本采集 选取2015年10月至2017年12青海大学附属医院食管癌手术切除标本及对应的癌旁组织各52例，其中男32例，女20例，年龄61～83岁，平均(69.28±5.74)岁，患者术前均未接受化疗、放疗等其他疗法，组织标本分别取自癌旁组织4 cm内、无坏死癌灶及正常黏膜组织，经4%多聚甲醛固定，脱水，包埋后连续切片，厚度4 μm，随后进行苏木素-伊红染色，经专业病理科老师诊断确诊为食管癌。高分化21例，中分化15例，低分化16例；浸润深度：浅层19例，深层33例；伴淋巴结转移者23例，无淋巴结转移者29例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期31例。标本采集经医院伦理委员会的审批和认可。

1.2.2细胞培养 ECA109和HET-1A使用含10%血清的高糖DMEM培养基，TE-1使用含10%血清的完全RPMI1640培养基，37℃、5%CO2条件培养。

1.2.3食管癌组织及癌旁组织中BDNF和TrkB的表达 采用免疫组织化学两步法检测食管癌和对应的癌旁组织中BDNF、TrkB的表达。染色步骤严格参照试剂盒说明书。一抗BDNF(1∶200)，TrkB (1∶250) 4℃过夜，采用DAB进行染色，由苏木素复染及分化。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。结果判定如下，BDNF和TrkB阳性表达均在细胞质或细胞膜上呈棕黄色或黄色，随机选取6个视野在400倍镜下(Leica，德国)观察，结合细胞着色深浅和阳性细胞占总细胞数的百分率进行判定。(1)细胞着色深浅评分：阴性为0分；呈浅黄色为1分；呈棕黄色为2分；呈棕褐色为3分。(2)阳性细胞数百分率评分：0%～30%为1分，31%～70%为2分，71%～100%为3分。两项评分的乘积大于或等于3分记为阳性表达，反之为阴性表达〔6〕。

1.2.4RT-PCR检测ECA019、TE-1和HET-1A细胞中BDNF、TrkB mRNA的表达 采用Trizol试剂一步法提取对数生长期细胞中的RNA，将细胞RNA反转录成cDNA，然后扩增成DNA(所有步骤严格按照逆转录试剂盒和扩增试剂盒说明书操作)。BDNF引物序列：上游：5-CTGTATCAAAAGGCCAACTGAA-3，下游：5-GTGTCTATCCTTATGAATCGCCA-3；TrkB引物序列：上游：5-CCAAGAGGCTAAATCCAGTCC-3，下游：5-CCAGGTTACCAACATCCCAATA-3；以GAPDH作为内参，引物序列：上游：5-CATGGGGTGTGAACCATGAGA-3；下游：5-GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3。引物序列均由上海生物工程技术有限公司合成。RT-PCR条件如下：95℃预变性10 min，循环(95℃，30 s；50℃，30 s；：70℃，1 min)40次，最后70℃延伸10 min结束。制1%琼脂糖凝胶，扩增产物点样后100 v电泳25 min，采用凝胶成像分析系统(Bio-Rad，USA)测定条带灰度值，以目的基因(BDNF、TrkB)与内参基因GAPDH灰度值的比值作为目的基因的相对表达量。

1.2.5Western印迹检测ECA019、TE-1和HET-1A细胞中BDNF、TrkB蛋白的表达 取处于对数生长期的细胞，PBS清洗2遍后，加入预冷的RIPA试剂提取细胞中的总蛋白。采用BCA法对提取的总蛋白进行蛋白的定量。配置浓缩胶，分离胶，取20 μg总蛋白点样，分离总蛋白后转膜，室温封闭1 h，加入鼠抗人BDNF单克隆抗体(1∶2 000)或兔抗人TrkB多克隆抗体(1∶1 500)4℃过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h，采用电化学发光(ECL)试剂显影。检测蛋白条带光密度值。

1.2.6CCK8检测外源性BDNF对食管癌细胞的增殖情况 取处于对数生长期的细胞，胰酶消化后用培养基重悬细胞至4×105～5×105个/ml。于96孔板每孔中加入100 μl细胞悬液，每组5个复孔，培养箱中放置24 h后待细胞完全贴壁。分别加入含20、40、80、160 ng/ml BDNF的1%血清的RPMI1640培养基，加入不含BDNF的1%血清的RPMI1640培养基作为0 ng/ml BDNF浓度对照，分别在培养1 d、2 d、3 d、4 d、5 d时，向每孔中加入10 μl的CCK8试剂，摇床上轻摇1 min后放置于培养箱中避光反应1 h，BIO-RAD680酶标仪上检测450 nm波长处各组的吸光度值(即OD值)，以每组复孔的平均值作为该组的OD值。

1.2.7Transwell检测外源性BDNF对食管癌细胞的侵袭情况 首先培养基润洗Transwell小室1遍，用不含血清的DMEM培养基配置基质胶至浓度为10 μg/μl，取50 μl均匀铺于小室上面，37℃培养箱中放置1 h确认凝固后加入无血清培养基重悬后的细胞200 μl，细胞数量控制在1×104个左右。将实验分为实验组和对照组，实验组下室内加入含80 ng/ml BDNF的培养基，对照组下室中则加入不含BDNF的培养基。药物处理24 h后，取出小室置于甲醇中固定20 min，将小室倒置风干后，0.1%结晶紫染色10 min，PBS清洗2遍后用棉签擦拭小室基质胶上面残留的细胞。于倒置显微镜(Leica，德国)下观察Transwell小室，100倍镜下随机选取6～8个视野计数的平均值作为穿过基底膜的平均细胞数。

1.3统计学方法 采用SPSS22.0软件进行χ2检验、t检验。

2 结 果

2.1BDNF和TrkB在食管癌组织中的表达 BDNF和TrkB阳性主要表达在食管癌细胞的胞质和胞膜上，阳性部分呈现棕黄色或黄色。食管癌组织标本中，BDNF、TrkB的阳性表达率显著高于癌旁组织(P<0.05)。见图1、图2、表1。

图1 BDNF在食管癌组织和癌旁组织中的表达 (SP，×400)

图2 TrkB在食管癌组织和癌旁组织中的表达 (SP，×400)

2.2食管癌组织中BDNF和TrkB的表达与临床病理特征的关系 食管癌组织中BDNF和TrkB的表达与患者的性别和年龄无显著相关性(P>0.05)；与肿瘤浸润深度、TNM分期、组织学分级、淋巴结转移有显著相关性(均P<0.05)。见表2。

表1 BDNF和TrkB在食管癌组织及癌旁组织中的阳性表达 〔n(%),n=52〕

2.3不同食管细胞中BDNF和TrkB mRNA的表达 食管癌细胞ECA109和TE-1中BDNF及TrkB mRNA的表达明显高于食管正常细胞HET-1A(P<0.05)。见表3。

2.4不同食管细胞中BDNF和TrkB蛋白的表达 食管癌细胞ECA109和TE-1中，BDNF和TrkB蛋白的表达显著高于食管正常细胞HET-1A。见表4和图3。

表2 BDNF和TrkB的表达与食管癌临床病理特征的关系〔n(%)〕

表3 不同食管细胞中BDNF和TrkB mRNA的表达

与HET-1A比较：1)P<0.05；表4同

表4 不同食管细胞中BDNF和TrkB蛋白的表达

图3 不同食管细胞中BDNF和TRKB蛋白的表达

2.5BDNF影响食管癌细胞TE-1的增殖 在第1天、第2天，不同浓度BDNF的细胞OD值变化不明显，第3、4、5天，40、80和160 ng/ml浓度BDNF的细胞OD值明显高于0 ng/ml BDNF浓度(P<0.05)，20 ng/ml和0 ng/ml BDNF浓度的细胞OD值比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

培养时间0 ng/ml20 ng/ml40 ng/ml80 ng/ml160 ng/ml第1天0.51±0.040.53±0.060.52±0.050.54±0.070.62±0.09第2天0.72±0.080.75±0.070.79±0.110.76±0.080.80±0.12第3天0.98±0.121.02±0.141.28±0.151)1.31±0.141)1.52±0.171)第4天1.16±0.171.17±0.191.46±0.191)1.52±0.171)1.87±0.191)第5天1.35±0.201.39±0.181.95±0.221)2.02±0.211)2.24±0.211)

与同时间点的0 ng/ml 比较：1)P<0.05

2.6BDNF影响食管癌细胞TE-1的侵袭能力 实验组穿过基底膜的细胞数目〔(952.21±165.39)个〕显著高于对照组〔(206.24±12.67)个,P<0.05〕。见图4。

图4 BDNF对食管癌TE-1细胞侵袭能力的影响(×100)

3 讨 论

食管癌是消化道中最常见的肿瘤之一，近些年食管癌在全球的发病率和死亡率急剧上升〔7〕。目前治疗食管癌的手段还是首选手术切除，但是由于食管癌的具有高侵袭，高转移的生长特性导致患者治疗效果和预后不佳〔8，9〕。因此，寻找与食管癌生长特性相关的新靶点，深入对食管癌侵袭转移的分子机制研究可能，改善患者的预后，对临床治疗具有重要意义。

研究显示，BDNF能够与高亲和力的受体TrkB结合参与多种恶性肿瘤的发生发展〔10～12〕。魏秀娟等〔13〕的研究发现，在舌鳞癌组织中BDNF和TrkB的表达率远高于在正常舌黏膜组织。有研究报道在子宫内膜增生和子宫内膜癌组织中BDNF和TrkB呈现高表达，而在正常子宫内膜组织中两者的表达率很低甚至不表达，并且BDNF和TrkB的表达与患者子宫内膜的病变关系密切〔14〕。本研究结果发现在食管癌组织中BDNF和TrkB的表达显著高于癌旁组织，并且对食管癌患者的相关病理特征分析得出BDNF和TrkB与肿瘤的组织学分级、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期密切相关，提示BDNF、TrkB可能参与了食管癌的增殖与转移。有研究发现食管癌TE-1细胞的增殖迁移能力高于食管癌ECA109细胞〔15〕。而本研究在mRNA和蛋白水平分别检测了两种食管癌细胞株ECA109和TE-1中BDNF、TrkB的表达，发现BDNF和TrkB在TE-1细胞系中的表达高于ECA109，提示BDNF和TrkB可能调节食管癌细胞的增殖与转移。研究表明〔16，17〕，在大鼠肝癌模型中外源性BDNF可以通过调节热休克蛋白HSP90刺激细胞内源性BDNF分泌增加，促进肿瘤的增殖，侵袭与转移。在多发性骨髓瘤细胞中，外源性BDNF能够结合磷酸化细胞表面的TrkB受体，促进肿瘤细胞的增殖、迁移，在肿瘤细胞的发生发展中发挥重要作用〔18，19〕。本研究通过外源性BDNF刺激BDNF/TrkB信号轴，观察BDNF对食管癌细胞生物学行为的影响。结果显示，随着外源性BDNF处理浓度的增加和处理时间的延长，TE-1细胞的增殖能力明显增强，具有剂量时间依赖性。在众多BDNF与其他恶性肿瘤的研究中同样发现相同的结果，推测BDNF可能是通过激活TrkB受体，从而增强肿瘤细胞的增殖能力〔20〕。Transwell实验结果显示，外源性BDNF能够增加TE-1细胞穿过基底膜的数量，使其侵袭能力增强。因此BDNF/TrkB可能作为食管癌治疗的新靶点。但是有关BDNF/TrkB调节肿瘤细胞增殖与转移的分子作用机制尚不明确，有待后续深入研究。

综上所述，食管癌组织中BDNF、TrkB异常高表达，且BDNF/TrkB在食管癌的发生发展中发挥着重要的作用，有可能成为抗癌治疗的新靶点。