何风艳，何 轶，王菲菲，戴 忠，马双成

（中国食品药品检定研究院，北京 100050）

薄荷为唇形科植物薄荷Mentha haplocalyxBriq.的干燥地上部分，具有疏散风热、清利头目、利咽、透疹、疏肝行气等功效［1］。薄荷的药用历史悠久，早在三国时期华佗的《丹方大全》 鼻病方中就多处提及薄荷入药［2］。作为常用中药，薄荷在中药制剂中的使用也非常广泛，在2015 年版《中国药典》 中收录的含薄荷、薄荷素油、薄荷脑的中成药就达到130 多种。留兰香又名绿薄荷、香花菜，为薄荷同属植物留兰香Mentha spicataL.干燥全草，原产南欧，目前我国河北、江苏等多个省份有栽培［3］。留兰香作为重要的香料植物，在食品、日用品等工业生产领域应用广泛［4］。留兰香是近年来薄荷的常见伪品［5-6］，二者虽为同属植物，但气味及化学成分存在差异［7-9］，不可混用。本实验收集薄荷和留兰香样品共18 批，对其挥发性成分进行比较研究，遴选可能的指标成分。在此基础上，以留兰香中的特征成分香芹酮为指标，对2 个常用中成药制剂牛黄镇惊丸、牛黄清胃丸进行薄荷伪品留兰香的检查，以期考察中药成方制剂中留兰香掺伪薄荷投料的情况，为监管提供依据。

1 材料

Agilent 7890B 气相色谱-7000C 三重四级杆质谱仪（美国Agilent 公司）；Mettler AE240、Mettler XS105DU 电子天平（瑞士梅特勒托利多公司）；KQ-300DA 型医用数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

对照品薄荷脑（批号110728-200506）、（-）薄荷酮（批号111705-201105）、胡薄荷酮（111706-201606）、α-蒎烯（110897-200502）、柠檬烯（批号100470-201503）、芳樟醇（111503-201603）、桉油精（110788-201506）、乙酰薄荷酯（批号190044-201001），均购于中国食品药品检定研究院；香芹酮对照品（批号C110521000-00610）购自德国Dr.Ehrenstorfer 公司。

薄荷药材12 批，编号1～12，购自北京、太原、阜阳等市各药店，留兰香新鲜样品6 批，标号13～18，购自北京市各花卉市场，经中国食品药品检定研究院张南平主任药师鉴定分别为Mentha haplocalyxBriq.和Mentha spicataL.；牛黄镇惊丸8 批，来自2 家生产企业；牛黄清胃丸49批，来自18 家生产企业。乙酸乙酯（分析纯）购自北京化学试剂厂。

2 主要挥发性成分分析

2.1 对照品溶液制备 精密称取薄荷脑、（-）-薄荷酮、胡薄荷酮、α-蒎烯、柠檬烯、芳樟醇、桉油精、香芹酮、乙酰薄荷酯对照品适量，分别加乙酸乙酯制成每1 mL 含1.4、1.3、1.3、1.7、1.0、2.5、1.5、2.8、2.1 mg 的溶液，作为对照品贮备液；分别精密移取上述对照品贮备液适量，逐级稀释，得到每1 mL 含薄荷脑、（-）薄荷酮、胡薄荷酮、α-蒎烯、柠檬烯、芳樟醇、桉油精、香芹酮、乙酰薄 荷酯2.8、2.6、2.6、3.4、2.0、5.0、3.0、5.6、4.2 g 的混合溶液，即得。

2.2 供试品溶液制备 精密称取薄荷或留兰香0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入乙酸乙酯溶液10 mL，密塞，称定质量，冰浴下超声处理（功率300 W，频率40 kHz）20 min，放冷，再称定质量，乙酸乙酯补足减失质量，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3 分析条件 采用HP-5 MS 毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为氦气；程序升温，初始温度50 ℃，5 ℃/min升至150 ℃，20 ℃/min 升至270 ℃，保持10 min；分流比10∶1；进样口温度220 ℃；进样量1 μL。

质谱接口温度300 ℃；离子源温度230 ℃；电子轰击电离（EI）模式；轰击能量70 eV；扫描方式：一级质谱全扫描（TIC），使用多反应监测（MRM）对香芹酮进行检测，检测离子对m/z150～135（定量离子对），150～91（定性离子对），碰撞能量均为5 eV。

2.4 TIC 检测结果 取薄荷和留兰香样品，在“2.3”项条件下进行TIC 检测。经NIST MS Search 2.0 检索，共鉴定出15 个化合物，其中9 个化合物经对照品比对确证。各化合物的相对含有量见表1，总离子流图见图1。

表1 不同样品挥发性成分（%）

薄荷样品TIC 图谱中主要为薄荷脑的色谱峰，部分薄荷样品TIC 图谱中较明显的色谱峰还有薄荷酮、胡薄荷酮、氧化胡椒酮或乙酰薄荷酯的色谱峰。留兰香样品的TIC 图谱中主要为香芹酮和柠檬烯的色谱峰，其中香芹酮色谱峰最高。

为了进一步挖掘薄荷和留兰香TIC 检测数据的差异，针对9 种已鉴定成分，以各成分所占比值为指标，采用SPSS 19.0 进行统计分析。聚类分析结果表明，12 批薄荷样品（编号1～12）和6 批留兰香样品（编号13～18）可明显分为2 类，见图2。主成分分析结果表明，第一主成分（PC1）的贡献率为55.72%，第二主成分的贡献率为（18.16%），累计达到73.88%，能比较全面地反映样品信息的差异。与PC1 密切相关的指标依次为香芹酮（0.971）、柠檬烯（0.962）、薄荷脑（-0.943）、桉油精（0.936），与PC2 密切相关的指标主要为胡薄荷酮（0.780）。样品得分图显示，12 批薄荷和6 批留兰香各自聚为一类，见图3。结合TIC 图谱可以看出，香芹酮色谱峰为6 批留兰香样品中独有，薄荷脑色谱峰为12 批薄荷样品中独有，柠檬烯和桉油精色谱峰在二者中均可检出，仅存在峰高差异。香芹酮可以作为指标成分检测薄荷药材中掺伪的留兰香。此外，柠檬烯和桉油精对于薄荷和留兰香的鉴别也具有一定意义，可作为辅助指标成分用于复杂样品的鉴别。上述结果与文献［6-8］基本一致。

2.5 MRM 检测结果 为进一步考察香芹酮作为留兰香检查指标的专属性，本实验还采用MRM 法对18 批薄荷及留兰香中的香芹酮进行测定。与TIC 法相比，MRM 测定专属性更强，灵敏度更高，可测定样品中痕量的香芹酮。结果表明，12 批薄荷样品中均无香芹酮色谱峰检出，6 批留兰香样品中有明显香芹酮色谱峰检出。因此，香芹酮可作为指标成分以区别留兰香与薄荷。

3 中成药中薄荷伪品留兰香检查

根据薄荷药材及留兰香样品挥发性成分对比的结果，以香芹酮为指标，选择牛黄镇惊丸、牛黄清胃丸2 个中成药进行薄荷伪品留兰香的检查。

图1 各样品总离子流图

图2 18 批样品聚类树状图

图3 18 批样品主成分分析图

3.1 供试品溶液制备 精密称取牛黄镇惊丸1.5 g 或牛黄清胃丸6.0 g，加入等量硅藻土，研细，置具塞锥形瓶中，精密加入乙酸乙酯溶液20 mL，密塞，称定质量后，冰浴下超声处理（功率300 W，频率40 kHz）20 min，放冷，再次称定质量，乙酸乙酯补足减失质量，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

3.2 检查方法 在“2.3”项条件下，采用多反应监测（MRM）模式，对香芹酮m/z150～135，150～91 进行检测。

3.3 专属性 取牛黄镇惊丸、牛黄清胃丸样品按照规定方法测定，结果表明，在香芹酮对照品保留时间处，阴性样品中未见干扰，专属性良好，见图4～5。

图4 牛黄镇惊丸多反应监测色谱图

图5 牛黄清胃丸多反应监测色谱图

3.4 检出限

3.4.1 仪器检出限 取香芹酮对照品贮备液，逐级稀释，并进样测定，以信噪比3∶1 为仪器检出限，得到香芹酮的仪器检出限为20 ng/mL。

3.4.2 方法检出限 取牛黄镇惊丸、牛黄清胃丸未检出香芹酮的阴性样品各1 丸，分别加入质量浓度为55.66 g/mL的香芹酮对照品溶液5～40 μL 后，按“3.1”项下方法制备供试品溶液，进样测定，以信噪比3∶1 为检出限，得到牛黄镇惊丸和牛黄清胃丸的方法检出限分别为0.42 μg/丸、0.83 μg/丸。

3.5 结果判定 2015 年版《中国药典》（四部）药材和饮片检定通则项下规定“药屑杂质通常不得过3%”。根据文献［3］，留兰香中含油率0.6%～0.7%，精油中香芹酮含有量60%～65%，以留兰香含油率0.7%、香芹酮含有量60%计，得到牛黄镇惊丸、牛黄清胃丸薄荷处方量3%留兰香中的香芹酮为3.39、9.22 μg。取未检出香芹酮的牛黄镇惊丸、牛黄清胃丸阴性样品各1 丸，分别加入3.39、9.22 μg 香芹酮，按“3.1”项下方法制备供试品溶液，在“3.2”项条件下测定。牛黄镇惊丸、牛黄清胃丸阳性样品香芹酮的色谱峰面积应不得高于各自香芹酮添加阳性样品的峰面积。

3.6 样品检测 取8 批牛黄镇惊丸和49 批牛黄清胃丸样品，分别按“3.1”项下方法制备供试品溶液，在“3.2”项条件下测定。结果表明，8 批牛黄镇惊丸样品中，有3批检出香芹酮，其中2 批香芹酮色谱峰面积较小，1 批香芹酮色谱峰面积远高于香芹酮添加样品的峰面积；49 批牛黄清胃丸样品中，11 批中可检出香芹酮，峰面积均低于香芹酮添加样品的峰面积。

4 讨论

薄荷原产我国，在南北各省均有分布。它的药用历史悠久，在《新修本草》 《本草纲目》 《植物名实图考》 等历代本草中均有记载，且古今药用薄荷品种一致［2，10］。留兰香原产南欧，自1950 年起开始在我国大规模引种［4，11］，因此留兰香非我国传统使用的薄荷。在临床功效方面，薄荷疏散风热、清利头目、利咽、透疹、疏肝行气，主要用于风热感冒、头痛、目赤、风疹麻疹等症；留兰香则具有疏风清热、解表和中、理气止痛的功效，可用于腹胀、吐泻、痛经、肢麻、跌扑肿痛等症，二者存在一定差异。目前我国种植的留兰香主要用于留兰香精油的生产，作为药用使用较少。新研究表明，留兰香还可用于痔疮［12］、习惯性便秘［13］、萎缩性胃炎［14］、慢性及溃疡性结肠炎［15］以及妇科炎症［16］的治疗。鉴于功效差异，留兰香不应替代薄荷使用，有必要建立含薄荷中成药中留兰香的检查方法。

薄荷属植物除少数种外，在北半球温带地区分布广泛。其精油的化学组成随栽培地区、气候条件、收获期等因素存在差异［17-19］。基于化学分析对薄荷药材商品规格划分研究表明，挥发油含有量与L-薄荷醇含有量正相关，建议L-薄荷醇含有量可作为薄荷药材商品规格和等级划分的标准之一［20］。结合本实验研究结果，可以认为香芹酮是区别于薄荷和留兰香的主要指标性成分。

本实验采用GC-MS/MS 法对制剂中留兰香进行检测，具有较高的灵敏度。对于13 批检出微量香芹酮的阳性样品，其检出原因可能为薄荷原料掺入少许留兰香所致，也不排除药材种质变异所导致。而对于检出大量香芹酮的阳性样品（峰面积远大于香芹酮添加样品），则存在留兰香掺伪薄荷投料的可能，建议相关厂家加强原料质量管理，以杜绝此类情况发生。在今后还应持续关注薄荷品种问题，保证临床用药的有效性。

《中华本草》 中记载含香芹酮的中药除留兰香外，含有鱼香草、五香草、石荠苧、荆芥、艾叶、茵陈蒿、白豆蔻、五色梅、藏茴香、柴胡、莳萝子、乳香、岗松、麻根、紫菜、石莼等16 种［21］。牛黄镇惊丸、牛黄清胃丸处方中均不包含上述药味。但是进一步检索发现，个别文献报道牛黄清胃丸中的菊花中含有少量的香芹酮［22-23］。本实验中有部分批次的牛黄清胃丸中可检出微量香芹酮，有可能就是由菊花药材引入。上述样品中检出的香芹酮含有量均较低，约为拟定限度的30%，对测定未构成影响。但是，菊花作为观赏和药用植物，栽培历史悠久、类群多样，不同药用类型的挥发油含有量及其组成存在显著差异［24-27］，且目前香芹酮在菊花中的检出结果文献报道也不统一。本实验结果显示，菊花中可能含有的香芹酮并未影响测定结果，但仍然有待进一步研究确认。