HPLC 法同时测定十三味和中丸中9 种成分

2020-05-12倩杨满琴鲍学梅葛丹丹徐国兵胡云飞谢若男

中成药 2020年2期

徐倩杨满琴鲍学梅葛丹丹徐国兵胡云飞谢若男∗

（1.安徽中医药大学第二附属医院，安徽合肥 230061；2.安徽省食品药品检验研究院，安徽合肥 230051；3.安徽中医药大学，安徽合肥 230031；4.亳州学院，安徽亳州 236800）

十三味和中丸是由安徽中医药大学第二附属医院研制的特色院内制剂，由柴胡、枳壳、延胡索、炒白芍、陈皮、酒黄连、酒黄芩、川楝子、姜半夏、吴茱萸、茯苓、砂仁、甘草13 味药材组成，具有疏肝理气、和胃止痛之功效［1］，主要用于治疗胃脘胀痛、嘈杂、嗳气等症，临床应用二十多年，疗效显著。但该方药味较多，组成复杂，单一成分分析很难全面反映其特征，而且不同成分吸收波长也有很大差异，目前尚无完整的质量评价体系［2-3］。

多波长HPLC 法测定复杂体系含有量已有很多相关报道［4-6］，目前主要依据复方中君臣佐使关系选择君药或臣药，或成方中用量较大的药材、特殊用药作为考察指标［7］，并依据2015 年版《中国药典》一部选择具体药材的指标成分。本实验在此基础上，建立HPLC 法同时测定十三味和中丸中芍药苷、延胡索乙素、盐酸小檗碱、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷、甘草酸、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 的含有量，以期提供多指标评价该制剂质量的方法。

1 材料

1.1 仪器 U-3000 高效液相色谱仪（配置DAD检测器）、FB15065 超声波清洗器（美国Thermo 公司）；XPE-205 电子分析天平（0.001 mg，瑞士Mettler-Toledo 公司）。

1.2 试剂与药物十三味和中丸（批号20170616、20170915、20171214、20180318、20180615，编号SSW1～SSW5，每10 丸重1.5 g）购于安徽中医药大学第二附属医院制剂室。芍药苷（批号110736-201640，质量分数95.20%）、延胡索乙素（批号110726-201011，质量分数99.90%）、盐酸小檗碱（批号110713-201212，质量分数86.70%）、柚皮苷（批号110722-201714，质量分数94.30%）、橙皮苷（批号110721-201316，质量分数95.30%）、黄芩苷（批号110715-201318，质量分数93.30%）、甘草酸铵（批号110731-201418，质量分数93.10%）、柴胡皂苷a（批号110777-201309，质量分数92.00%）、柴胡皂苷d（批号110778-201409，质量分数96.00%）对照品均购于中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈为色谱纯，购于美国Tedia 公司；磷酸为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；水为超纯水［屈臣氏集团（香港）有限公司］。

2 方法

2.1 供试品溶液制备称取本品干燥粉末（过3 号筛）约0.50 g，置于50 mL 锥形瓶中，精密量取70%甲醇20 mL，密塞，称定质量，超声处理40 min（250 W、50 kHz），放冷，70%甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2 对照品溶液制备精密称取芍药苷、延胡索乙素、盐酸小檗碱、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷、甘草酸铵、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 对照品适量，置于25 mL 量瓶中，70%甲醇定容至刻度，分别制成10.591、18.176、76.167、58.842、99.172、275.825、42.408、51.244、58.678 μg/mL 对照品溶液（甘草酸质量=甘草酸铵质量/1.020 7）。

2.3 色谱条件 Waters SunfireTMC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脱，程序见表1；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长210、230、283、345 nm；进样量10 μL。色谱图见图1。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察精密吸取对照品溶液0.5、1、2、5、10 mL，置于10 mL 量瓶中，70%甲醇定容，混匀，得到系列质量浓度溶液B1～B5，在“2.3”项色谱条件下进样测定。以峰面积为纵坐标（Y），溶液质量浓度为横坐标（X）进行回归，信噪比（S/N）≥10 为定量限，S/N≥3 为检测限，结果见表2，表明各成分在各自范围内线性关系良好。

2.4.2 精密度试验精密吸取对照品溶液（B3）5.0 μL，在“2.3”项色谱条件下进样测定6 次，测得芍药苷、延胡索乙素、盐酸小檗碱、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷、甘草酸、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 峰面积RSD 分别为2.04%、1.81%、1.23%、0.91%、0.77%、0.56%、0.97%、1.63%、1.54%，表明仪器精密度良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4.3 稳定性试验取供试品溶液（SSW1），分别于0、2、4、8、12、24 h，在“2.3”项色谱条件下进样测定，测得芍药苷、延胡索乙素、盐酸小檗碱、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷、甘草酸、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 峰面积RSD 分别为1.93%、1.69%、1.03%、0.89%、0.86%、0.41%、0.94%、1.53%、1.37%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验取同一批本品（SSW1）粉末6 份，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样测定，测得芍药苷、延胡索乙素、盐酸小檗碱、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷、甘草酸、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 峰面积RSD分别为0.97%、0.88%、0.71%、0.63%、0.66%、0.24%、0.61%、0.68%、0.78%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验称取含有量已知的本品（SSW1）粉末约0.50 g，精密加入适量对照品溶液，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样测定，计算回收率。测得芍药苷、延胡索乙素、盐酸小檗碱、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷、甘草酸、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d平均加样回收率分别为100.1%、99.7%、99.3%、99.8%、100.4%、99.5%、95.1%、102.3%、97.7%，RSD 分别为 0.64%、1.89%、1.43%、0.74%、0.85%、1.76%、0.84%、0.48%、3.11%。

2.5 样品含有量测定取5 批本品，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样测定，外标法计算含有量，结果见表3。

3 讨论

3.1 指标成分选择中成药组分较多，制备工艺复杂，使其质量难以得到较好的控制［8-9］。十三味和中丸由四逆散、左金丸、金铃子散、二陈汤四方相合，配伍黄芩、砂仁2 味药材而成，以四逆散为疏肝理气之母方，并以大量枳壳替代枳实，全方以枳壳为君药，柴胡、炒白芍、姜半夏、陈皮、延胡索为臣药［10］。前期曾考虑选择母方中3 味药材（柴胡、炒白芍、甘草）、君药与臣药（枳壳、柴胡、炒白芍、姜半夏、陈皮、延胡索）、额外配伍药（酒黄芩、砂仁）作为研究对象，但砂仁有效成分大多为挥发性物质，2015 年版《中国药典》采用GC 法进行定量测定，而半夏含有量在药典中采用电位滴定法进行测定，故未选择两者作为质控指标。结合处方用量（酒黄连用量较大），本实验最终选择枳壳、柴胡、炒白芍、陈皮、延胡索、酒黄连、酒黄芩、甘草8 味药材，并参考药典方法对其特征性成分（如枳壳中柚皮苷、炒白芍中芍药苷等）进行分析。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

表3 各成分含有量测定结果（mg/g）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg/g）

3.2 提取条件选择本实验以不同体积分数甲醇、乙醇为溶剂，考察了超声、回流、索氏提取及不同提取时间。综合考虑方法稳定性、便捷性、提取效率，最终选择70%甲醇超声处理40 min 作为供试品溶液提取方法。

3.3 流动相选择本实验考察了不同比例甲醇/乙腈-磷酸盐缓冲液系统，最终选择乙腈-0.2% 磷酸作为流动相，此时色谱峰分离度、峰形良好。同时，将洗脱时间延长到128 min，也为指纹图谱（或特征图谱）等后续研究提供基础。

3.4 检测波长选择根据不同成分在紫外光下的吸收情况，本实验选择最大吸收波长（或其左右）以避免其他物质干扰，保证测定准确性。结合2015 年版《中国药典》，最终确定各成分检测波长分别为210 nm（柴胡皂苷a、柴胡皂苷d）、230 nm（芍药苷、甘草酸）、283 nm（芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷）、345 nm（盐酸小檗碱），此时色谱峰分离度、峰形理想，可用于定量分析。