刘丽娟 郭紫薇 陈晶泽

摘要：目的  分析電子烟烟雾气体染毒对C57BL/6小鼠肠道菌群的影响。方法  将60只7周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为电子烟12 mg尼古丁组，电子烟0 mg尼古丁组，空气对照组（阴性对照组），传统烟组（阳性对照组）4组，每组15只。使用一种仿生模拟人体呼吸系统吸烟的生发装置对C57BL/6小鼠进行染毒，并对粪便基因组DNA提取及细菌16S rDNA扩增子测序，分析电子烟烟雾染毒对肠道菌群α多样性、β多样性、肠道菌群在门、属水平的影响及其对肠道菌群群落组成及结构的影响。结果  烟雾染毒后电子烟组（电子烟12 mg尼古丁组，电子烟0 mg尼古丁组）肠道微生物α多样性多于空气对照组，β多样性少于空气对照组，拟杆菌门和乳杆菌的丰富度低于空气对照组，厚壁菌门和Alistipes的丰富度高于空气对照组;电子烟12 mg尼古丁组拟杆菌属的丰富度低于空气对照组，而电子烟0 mg尼古丁组拟杆菌属的丰富度高于空气对照组;PCA分析结果显示，各电子烟组与同期空气对照组群落组成存在差异;UPGMA聚类分析结果显示，电子烟组与空气对照组相比肠道菌群群落结构发生改变，电子烟组（电子烟12 mg尼古丁组与电子烟0 mg尼古丁组）菌群结构较为相似，而与空气对照组的相似度却较低。结论  电子烟烟雾染毒会对小鼠肠道菌群产生影响，从而导致实验小鼠肠道菌群失调，且烟雾染毒对小鼠肠道菌群产生影响的成分可能不只是尼古丁，其他非尼古丁化学物质同样可能造成肠道菌群的失调。

关键词：电子烟;烟雾染毒;肠道菌群;菌群失调;致病因子

中图分类号：TS458;R363                           文献标识码：A                               DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.06.027

文章编号：1006-1959（2020）06-0072-04

Abstract：Objective  To analyze the effect of e-cigarette smoke gas exposure on the intestinal flora of C57BL/6 mice. Methods  Sixty 7-week-old male C57BL / 6 mice were randomly divided into an e-cigarette 12 mg nicotine group， an e-cigarette 0 mg nicotine group， an air control group （negative control），traditional smoke group （positive control group） 4 groups， 15 in each group. C57BL/6 mice were infected with a hair growth device that mimicked smoking in the human respiratory system， and fecal genomic DNA extraction and bacterial 16S rDNA amplicon sequencing were performed to analyze the e-cigarette smoke exposure to the intestinal flora α Effects of β-diversity， intestinal flora on the genus level and its effect on the composition and structure of intestinal flora.Results  After smoke exposure， the e-cigarette group （e-cigarette 12 mg nicotine group， e-cigarette 0 mg nicotine group） had more intestinal microbial α diversity than air control group， β diversity less than air control group， Bacteroides and Lactobacillus The richness is lower than that of the air control group， and the abundance of Pachyphyte and Alistipes is higher than that of the air control group; the richness of Bacteroides in the 12 mg nicotine group of e-cigarettes is lower than that in the air control group， and that of 0 mg nicotine group in e-cigarettes Genus richness is higher than the air control group; PCA analysis results show that there is a difference in community composition between the e-cigarette group and the air control group over the same period; UPGMA cluster analysis results show that the intestinal flora community structure of the e-cigarette group compared with the air control group the e-cigarette group （e-cigarette 12 mg nicotine group and e-cigarette 0 mg nicotine group） had a similar flora structure， but the similarity with the air control group was lower.Conclusion  The e-cigarette smoke exposure will affect the intestinal flora of mice， which will cause the intestinal flora of experimental mice to be imbalanced， and the components of smoke intoxication that may affect the intestinal flora of mice may not be only nicotine， other non- nicotine chemicals can also cause imbalances in the intestinal flora.

Key words：Electronic cigarette;Smoke exposure;Intestinal flora;Flora imbalance;Pathogenic factors

肠道微生物群是一个多样化的菌群[1]，与宿主免疫存在双向关系[2]，在宿主免疫的发展是由微生物群介导宿主免疫的同时也不断受到宿主免疫的调节。肠道微环境是由肠道微生物群落及其代谢产物（短链脂肪酸等）和肠粘膜免疫系统形成的，在机体健康状态下通常处于动态平衡状态。肠道微生物已成为影响人类健康和疾病的核心因素，其多样性的丧失与人类和其他哺乳动物中的各种胃肠道和全身性疾病相关[6]。肠道菌群是肠道微环境的重要组成部分，因此，保证肠道菌群的动态平衡至关重要[3]。多种因素包括环境化学物质均可对肠道菌群造成影响，导致各种动物的肠道微生物群破坏，称为肠道菌群失调[4]。而任何肠道菌群构成的改变都叫微生物群失调。吸烟是影响人肠道微生物群组成的重要环境因素[5]。因此肠道菌群所参与的各类代谢途径和环节可对机体的各个系统和组成环境造成不同程度的影响，可能成为很多疾病发生发展的危险因子。电子烟又名电子尼古丁传送系统，通过电池加热使得烟油高温雾化吸入人体，以模仿吸食卷烟的过程，其在使用过程中是否会造成机体肠道菌群失调尚不清楚，本研究使用一种仿生模拟人体呼吸系统吸烟的生发装置对C57BL/6小鼠进行染毒，并对粪便基因组DNA提取及细菌16S rDNA扩增子测序分析，探讨电子烟烟雾气体染毒对C57BL/6小鼠肠道菌群的可能影响，现报道如下。

1材料和方法

1.1实验动物与分组  60只7周龄雄性C57BL/6小鼠，SPF级别，常规喂养，体重（20±2）g，购自空军军医大学（原第四军医大学）实验动物中心，合格证：SYXK（陕）2016-005，自由获取食物和水，12 h光照和12 h黑暗循环，环境温度（21±2）℃，湿度（50%±10%）。小鼠适应性喂养1周，从第2周开始进行烟雾染毒，连续4周。将小鼠采用随机数字表法分为4组，每组15只，每笼5只，分别为电子烟12 mg尼古丁组，电子烟0 mg尼古丁组，空气对照组（阴性对照组），传统烟组（阳性对照组）。

1.2方法

1.2.1烟雾染毒  通过使用本研究团队授权获批的 发明专利装置：一种仿生模拟人体呼吸系统吸烟的生发装置（专利号：ZL201721438419.0）将烟气气体传送至静式染毒柜（型号8050-1，天津开发区合普工贸有限公司）染毒。根据实验动物体重以及体表面积的指标计算，确定染毒时间和频次：按照8点，14点，20点三个时间段进行烟气染毒，3次/d，30 min/次，持续染毒4周。用鼠体表面积与正常成年人体表面积进行换算，根据每人20支/d的吸烟量计算得出实验用鼠每天进行烟气染毒所消耗的传统卷烟数量和频次;并根据传统烟阳性对照的尼古丁消耗，等量计算出电子烟烟油的消耗量，染毒持续的时间保持一致，进行电子烟的烟气染毒。以人的平均年龄与小鼠的平均年龄换算，小鼠染毒4周，相当于人吸烟达到5年以上。根据Meeh-Rubner氏公式计算得出本次实验烟雾染毒的浓度为6.19%。实验使用的染毒仓体积为100 L，小鼠30 min内吸取的烟气量为100 L×6.19%=6.19 L（约需要2支香烟），根据传统烟组的烟气尼古丁量，对等使用相同含量的电子烟12 mg尼古丁。本实验使用同一型号的静式染毒柜，保证染毒仓的体积大小相等。每次实验严格按照计算的传统烟支数，电子烟烟液量进行实验烟雾染毒。负责染毒的实验人员提前培训，统一染毒标准且在整个染毒过程中负责染毒的实验人员固定不变。保证产生烟雾染毒型小鼠同时保证每次烟雾染毒时烟雾浓度一致。

1.2.2粪便基因组DNA提取及细菌16S rDNA扩增子测序  ①粪便基因组DNA的提取：根据制造商说明书使用粪便基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）提取，样本送测序公司检测。②PCR扩增：利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1 ng/μl。以稀释后的基因组 DNA 为模板，选择16S V4区引物（515F和806R）， Phusion  High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶（New England Biolabs）进行PCR。③PCR产物的混样和纯化：PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测，根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用1×TAE 浓度2%的琼脂糖胶电泳纯化PCR 产物，剪切回收目标条带。使用产物纯化试剂盒即GeneJET 胶回收试剂盒（Thermo Scientific）回收产物。④文库构建和上机测序：使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建库试剂盒（Thermofisher）进行文库的构建，将构建好的文库经过Qubit 定量和文库检测合格后，使用的Ion S5TMXL（Thermofisher）进行上机测序。

1.3观察指标  ①电子烟烟雾染毒对肠道菌群α多样性、β多样性以及肠道菌群在门、属水平的影响;②电子烟烟雾染毒对肠道菌群群落组成的影响;③电子烟烟雾染毒对肠道菌群群落结构的影响。

1.4统计学方法  ①测序数据处理：使用Cutadapt（V1.9.1，）对reads进行低质量部分剪切，再根据16S V4区引物初步质控得到原始数据（Raw reads）并去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据（Clean Reads）。②使用Qiime软件（Version 1.9.1）计算ACE，组间差异分析行参数检验和非参数检验，多组比较采用Tukey检验和agricolae包的wilcox檢验。③Beta多样性组间差异分析的箱形图可以直观的反应组内样本相似性的中位数，离散程度，最大值，最小值，异常值。④组间物种Beta多样性采用 wilcox秩和检验。⑤使用R软件（Version 2.15.3）绘制PCA图。PCA分析使用R软件的ade4包和ggplot2软件包。⑥用Qiime软件（Version 1.9.1）计算Unifrac距离、构建UPGMA样品聚类树。

2结果

2.1电子烟烟雾染毒对肠道菌群α多样性、β多样性以及肠道菌群在门、属水平的影响  烟雾染毒4周结果分析显示电子烟组肠道微生物组α多样性多于空气对照组（图1），β多样性少于空气对照组（图2）;电子烟组的拟杆菌门和乳杆菌的丰富度低于空气对照组，厚壁菌门和Alistipes的丰富度高于空气对照组（图3A、图3B）。电子烟12 mg尼古丁组拟杆菌属的丰富度低于空气对照组，而电子烟0 mg尼古丁组拟杆菌属的丰富度高于空气对照组（图4A、图4B）。

2.2电子烟烟雾染毒对肠道菌群群落组成的影响  PCA分析结果显示各电子烟组与同期空气对照组群落组成存在差异。第一主成分对各组群落结构差异的贡献值为14.38%，第二主成分对各组差异的贡献值为9.85%，（见图5）。

2.3电子烟烟雾染毒对肠道菌群群落结构的影响  UPGMA聚类分析结果显示电子烟组与空气对照组相比肠道菌群群落结构发生改变，电子烟组（电子烟12 mg尼古丁组与电子烟0 mg尼古丁组）菌群结构较为相似，而与空气对照组的相似度却较低，见图6。

3讨论

本研究结果显示，电子烟组（电子烟12 mg尼古丁，电子烟0 mg尼古丁）烟雾染毒4周会使肠道微生物组α多样性，β多样性及门、属的丰富度与同期空气对照组相比发生显著变化，对小鼠肠道菌群群落组成及群落构成产生影响，从而引起小鼠肠道菌群失衡。有研究表明[7]，乳杆菌会降低血脂含量（如胆固醇和甘油三酯），肠道微生物可以通过多种直接和间接的生物學机制影响宿主脂质代谢。本研究结果显示，12 mg尼古丁组、电子烟0 mg尼古丁组的乳杆菌属丰富度与空气对照组相比都有所降低。由此推测烟雾暴露使得乳杆菌属丰富度降低从而降低了宿主降低血脂的能力使得宿主TC、TG增加，可能增加心血管疾病的风险。

PCA分析结果显示，电子烟组、传统烟组与空气对照组均存在差异，说明传统烟、电子烟12 mg尼古丁，电子烟    0 mg尼古丁都会对肠道菌群的平衡产生一定影响，推测包括尼古丁在内的电子烟中的化学物质都会对肠道菌群产生影响。

此外，电子烟组与空气对照组相比肠道菌群结构都有所改变，且空气对照组与传统烟组菌群结构较为相似，电子烟12 mg尼古丁组与电子烟0 mg尼古丁组菌群结构较为相似。由此推测烟雾染毒对小鼠肠道菌群产生影响的成分不只是尼古丁，电子烟中的非尼古丁化学物质同样可能造成肠道菌群的失调，甚至电子烟12 mg尼古丁和电子烟0 mg尼古丁中的非尼古丁化合物对肠道菌群影响可能超过尼古丁，但具体机制尚不清楚，今后需要继续针对电子烟     12 mg尼古丁、电子烟0 mg尼古丁对肠道菌群影响机制进行研究以及分离出传统烟、电子烟12 mg尼古丁、电子烟0 mg尼古丁中的有效成分，进一步分析导致肠道菌群的失调的具体成分。

参考文献：

[1]Barko PC，McMichael MA，Swanson KS，et al.The Gastrointestinal Microbiome：A Review[J].J Vet Intern Med，2018，32（1）：9-25.

[2]Koliada A，Syzenko G，Moseiko V，et al.Association between body mass index and Firmicutes/Bacteroidetes ratio in an adult Ukrainian population[J].BMC Microbiol，2017，17（1）：120.

[3]Lin L，Zhang J.Role of intestinal microbiota and metabolites on gut homeostasis and human diseases[J].BMC Immunol，2017，18（1）：2.

[4]Nie YF，Hu J，Yan XH.Cross-talk between bile acids and intestinal microbiota in host metabolism and health[J].J Zhejiang Univ Sci B，2015，16（6）：436-446.

[5]Biedermann L，Zeitz J，Mwinyi J，et al.Smoking cessation induces profound changes in the composition of the intestinal microbiota in humans[J].PLoS One，2013，8（3）：e59260.

[6]van de Wouw M，Boehme M，Lyte JM，et al.Short-chain fatty acids： microbial metabolites that alleviate stress-induced brain-gut axis alterations[J].J Physiol，2018，596（20）：4923-4944.

[7]Power SE，O'Toole PW，Stanton C，et al.Intestinal microbiota，diet and health[J].Br J Nutr，2014，111（3）：387-402.

收稿日期：2019-11-29;修回日期：2020-01-17

编辑/肖婷婷