李素媛 喻玺 黄龙

摘要：采用一種新的柱前衍生-反高效液相色谱法对15种水产品中的8种生物胺进行检测。利用C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，以乙腈和水混合液进行梯度洗脱，流速为0.8 mL/min，在254 nm波长下进行生物胺含量的测定。结果表明，在1.0～100 mg/L浓度范围内，8种生物胺的分离呈现良好的线性相关（R2≥0.998），方法的检出限及定量限均低于国标方法，加标平均回收率为90%～110%，该方法操作简单，衍生物稳定，杂质少，结果准确可靠，能对鱼及鱼类制品中的生物胺进行检测。

关键词：水产品;生物胺;高效液相色谱

中图分类号：TS254.7         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）01-0145-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.01.033           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： A new pre-column derivatization and reversed high performance liquid chromatography （RP-HPLC） was used to detect 8 biogenic amines in 15 kinds of aquatic products.，8 biogenic amines could be separated by a new precolumn derivatization method. The results showed that in the range of 1.0 to 100 mg/L， 8 biogenic amines showed a good linear correlation（R2≥0.998）， the detection limit and quantitative limit of the method were lower than that of the national standard method. The average recovery rate of the added standard was 90%～110%. The method was simple to operate，derivatives are stable， few impurity， accurate and reliable results， can be used to detect biological amines in fish and dried fish products.

Key words： aquatic products; biogenic amines; high performance liquid chromatography

生物胺是一类含氨基且具有生物活性的低分子有机化合物，过量的生物胺会引起头疼、低/高血压、腹泻和呕吐等，严重甚至会致人死亡。水产品及其制品在贮存运输过程更容易产生生物胺，因此生物胺含量的测定对渔产品及其制品的质量安全控制具有重要的意义。

《食品安全国家标准 食品中生物胺的测定》（GB 5009.208-2016）中第一法——液相色谱法是目前通用的同时测定水产品及其制品中8种生物胺的方法。该方法采用三氯乙酸提取，正己烷去脂肪，三氯甲烷-正丁醇萃取净化，丹磺酰氯作衍生剂，乙醚萃取衍生物，C18色谱柱分离，高效液相色谱-紫外检测器检测，内标法定量。丹磺酰氯衍生剂价格较贵，样品提取净化方法复杂，整个检测过程耗时较长，而且衍生物稳定性差，需要在规定的时间类检测完毕，对于大批量样品的检测存在局限性。本研究在国标方法的基础上，采用4-氟-3-硝基三氟甲苯（FNBT）作为衍生剂，N，N-二异丙基乙胺（DIPEA）为催化剂，同时对样品的前处理过程改进优化，对水产品中的8种生物胺进行检测。与国标方法相比，该方法缩短时间，操作简单，衍生物稳定，杂质少，结果准确可靠。

1  材料与方法

1.1   材料

1.1.1  试验样品  市售各种鱼及鱼干样品，购自超市及菜市场。

1.1.2  试剂  组胺、酪胺、尸胺、腐胺、β-苯乙胺、色胺、精胺、亚精胺标准品（纯度98%以上），Sigma公司;1，7-二氨基庚烷，内标标准品（纯度98%以上），4-氟-3-硝基三氟甲苯（FNBT）（纯度99%），N，N-二异丙基乙胺（DIPEA）（纯度99%），上海安谱科学仪器有限公司;色谱纯乙腈、甲醇、乙酸乙酯、乙酸胺，Merck公司;优级纯盐酸、硼酸、四硼酸钠，亚铁氰化钾、乙酸锌等，国药集团。GB 5009.208-2016标准中第一法高效液相色谱法所需试剂按国标要求购买并配制。

1.1.3  仪器  2695型高效液相色谱仪（Waters公司）;超纯水处理器（Milli-Q公司）;P-12型平行浓缩仪（BUCHI公司）;漩涡混合器（Talboys公司）;CF-16KH型落地冷冻离心机（日立（中国）有限公司）;PHSJ-4F 型pH酸度计（上海雷磁仪器厂）;TH2-82型水浴恒温振荡器（常州金坛精达仪器制造有限公司）。

1.2  方法

1.2.1  标准溶液和试剂的配制

1）标准生物胺溶液。准确称取各标准品100 mg，用0.1 mol/L盐酸溶解，并定容至100 mL，配成浓度为1.0 mg/mL的标准储备液，分别准确移取以上标准储备液1 mL混合均匀，用0.1 mol/L盐酸定容至10 mL，再用0.1 mol/L盐酸稀释成最终浓度分别为1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0 mg/L的标准混合溶液，4 ℃避光保存。

2）4-氟-3-硝基三氟甲苯（FNBT）衍生剂。用甲醇稀释20倍，室温保存。

3）内标标准溶液。准确称取内标标准品100 mg，用0.1 mol/L盐酸溶解，并定容至10 mL，配成浓度为10.0 mg/mL的标准储备液，置于-20 ℃保存。吸取1.0 mL内标标准储备液于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸定容到刻度，配制成1.0 mg/mL的中间液，再吸取1.0 mL中间液于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸定容到刻度，混匀，作为内标标准使用溶液，浓度为100 mg/L。

1.2.2  样品的提取与衍生

1）样品提取。准确称取5.0 g绞碎的样品于50 mL离心管中，加入0.5 mL内标中间液（浓度为1.0 mg/mL），与样品充分混合，加入20 mL的0.1 mol/L盐酸溶液，振荡提取30 min，加入5 mL亚铁氰化钾溶液（92 g/L），5 mL乙酸锌溶液（183 g/L），混均后离心10 min，转移上层清液至50 mL容量瓶中，加入20 mL的0.1 mol/L盐酸溶液重复提取1次，合并上清液，用0.1 mol/L盐酸溶液定容至50 mL。

2）样品衍生。准确移取1 mL试样提取液于15 mL具塞离心管中，用0.1 mol/L Na2B4O7缓冲液调节pH 9.5，加入2.0 mL 4-氟-3-硝基三氟甲苯（FNBT），20 uL N，N-二异丙基乙胺（DIPEA），置于恒温振荡水浴锅（60 ℃，30 min），取出后加入20 μL 2.0 mol/L盐酸溶液中断反应，室温反应5 min，用5 mL乙酸乙酯提取，涡旋振荡后离心10 min，收集上层有机层，重复提取3次，合并提取液于平行浓缩仪中旋干，残渣加入1.0 mL甲醇，涡旋溶解，过0.45 μm滤膜，液相色谱仪检测。

3）标准溶液衍生。分别移取1 mL生物胺标准系列溶液，置于15 mL具塞离心管中，依次加入100 μL内标溶液（100 mg/L），以下操作同试样的衍生步骤。

1.2.3  色谱条件  色谱柱：Waters C18色谱柱（粒径5 μm，4.6 mm×250 mm）紫外检测器，波长254 nm，进样量：20 μL，柱溫：35 ℃，流动相A为90%乙腈/10%（含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸铵溶液），流动相B为10%乙腈/90%（含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸胺溶液），流速0.8 mL/min。梯度洗脱程序见表1。

2  结果与分析

2.1  标准品与样品色谱图

标准品与试剂样品色谱分别如图1、图2。

2.2  标准曲线、检出限和定量限

水产品的国标检出限8种生物胺均为20 mg/kg，定量限均为50 mg/kg，以信噪比（S/N）大于3作为检出限的判断标准，以信噪比（S/N）大于10作为定量限的判断标准，本研究方法所测定的8种生物胺的检出限及定量限均低于国标，说明该检测方法灵敏度满足要求，两种方法的标准曲线的回归方程及线性见表2。

2.3  精密度及加标回收率

对浓度为10.0 mg/L的标准生物胺混合溶液，采用国标法及本研究方法所得衍生物，连续6次进样，各组分的峰面积及标准偏差见表3。同一个样品制样均匀后，用10.0、15.0 mg/L两个浓度的混合生物胺标准溶液进行加标回收，两种方法加标回收率见表4。从表3、表4可以看出，所测各项生物胺的精密度指标RSD均在5%以内，加标回收率在90%～110%之间，说明与国标方法相比，该方法也是可靠的。

2.4  样品检测

本研究方法对市售15种鱼、鱼干及鱼制品中生物胺的种类及其含量进行检测结果见表5。由表5可知，新鲜鱼类各种生物胺含量较低，主要测出组分为组胺、腐胺、酪胺、尸胺，其他生物胺组分含量较低或未检出。经过急速真空干燥加工处理的鱼干制品，如清江风味鱼各种成品等鱼类制品生物胺含量也较低，市售散装鱼干组胺、腐胺、尸胺等含量较高。

3  结论

本研究采用新的衍生方法，改进了样品前处理，同时测定水产品中8种生物胺。该方法稳定、操作简单、准确快速，对有效控制水产品质量大有帮助。目前，消费者及监督机构对渔产品及其制品控制项目多聚焦在兽药残留、抗生素残留及防腐剂上，偶尔监管部门会对组胺进行检测。从本研究检测结果可知，对水产品的新鲜程度也应加强控制和安全监督，对其他生物胺组分也应加强监测。

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