韩 雪,袁玮琼,武 艺,刘东伟,牟一晗,敖 璇,吕兆林

(1.北京林业大学生物科学与技术学院,北京 100083;2.北京林业大学公共分析测试中心,北京 100083;3.林业食品加工与安全北京市重点实验室,北京 100083)

蓝莓(Sementrigonellae)学名越桔,杜鹃花科越桔属,是一种经济价值较高的新兴浆果[1-3],蓝莓果营养丰富,富含花青甙、熊果甙、VE、VA等,故有“浆果之王”称号[4-6]。有研究表明,蓝莓具有多种保健功能,如改善视力、增强人体免疫力、预防心血管疾病、抗氧化、抗衰老、抑菌、抗癌等[7-8]。

蓝莓出色的保健功能主要取决于其富含的花青素成分。花青素是一种次生代谢产物,是黄酮类化合物中最重要的种类[9-13]。它具有较强的抗氧化活性,可预防多种癌症和动脉内斑块的形成,也可降低心脏疾病的患病率,延缓器官老化。另外花青素可激活人体内的免疫系统,增强机体免疫力,防止免疫蛋白受自由基侵害,还具有减轻眼疲劳、提高夜间视力的功能[14-15]。因此,快速检测蓝莓果中复杂且未知花青素类化合物成为近年来的研究热点。

有研究者利用紫外光谱(Ultraviolet visible spectrum,UV)测定蓝莓中花青素的含量,这种方法只能测定花青素的总量,不能确定花青素结构[16];也有学者将花青素提取物经柱层析、制备色谱、大孔树脂吸附等方法分离纯化,再采用核磁共振法、红外光谱法等之后利用仪器分析可以达到鉴定结构的目的,此种研究手段的前处理过程复杂、费时、定量分析困难,且不容易得到微量及痕量级化合物的结构信息[17-19]。目前,液质联用技术被认为是快速、准确检测花青素结构及含量的优良方法[20-24]。液质联用技术有两大分类系统,从质谱的离子源类型划分,可分为电喷雾离子源、大气压化学电离源、大气压光电离源和基质辅助激光解吸电离源等;从质谱的质量分析器角度划分,可分为四极杆、离子阱、飞行时间和傅立叶变换质谱等[25]。其中飞行时间(Time-of-flight,TOF)与质谱(Mass spectrometer,MS)联用或与串联质谱仪联用,可将TOF分离不同质量分子的能力与MS的结构表征能力有效地结合,是表征天然化合物结构的有力工具[26]。近年来,液相色谱电喷雾离子源与混合离子阱和高分辨率飞行时间质谱的联用,已成功应用于分离和表征多种化合物[27-28]。

本实验采用HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn技术,对埃利奥克(Elliott)、爱国者(Patriot)、北蓝(Northblue)、北陆(Northland)、杜克(Duke)、蓝丰(Bluecrop)6个品种蓝莓中的花青素结构进行研究,利用紫外可见光谱及多级质谱数据鉴定6种蓝莓花青素的结构,建立一种快速检测花青素的方法,解决了花青素标准品难以获得的问题,为鉴定不同品种蓝莓中花青素的结构差异,快速获取蓝莓中花青素的种类及结构提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蓝莓 丹东食品有限公司购入,品种分别为埃利奥克(Elliott)、爱国者(Patriot)、北蓝(Northblue)、北陆(Northland)、杜克(Duke)、蓝丰(Bluecrop);无水甲醇、盐酸 分析纯,北京化工厂;乙腈、甲酸 色谱纯,美国赛默飞世尔科技有限公司。

HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn二极管阵列高效液相色谱-电喷雾离子阱-飞行时间串联多级质谱仪 日本岛津公司;Zorbax SB C18柱、LXJ Ⅱ离心机 上海民用分析仪器厂;98-1-B型电子调温电热套 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蓝莓花青素的提取 采用刘亚等[15]的方法稍作改进提取蓝莓果中的花青素。准确称取2.0 g蓝莓果泥置于圆底烧瓶中,按固液比1∶15 g/mL加入50%甲醇水溶液回流提取1 h,提取温度为80 ℃,将提取液于8000 r/min下常温离心10 min,收集上清液,用0.25 μm的微孔滤膜过滤,利用HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn对蓝莓果实花青素的种类及结构进行分析。

1.2.2 HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn分析

1.2.2.1 液相色谱条件 色谱柱:Zorbax SB C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm);流动相组成:流动相A为5%甲酸水溶液,流动相B为乙腈;梯度洗脱程序:0 min,A:90%;0～10 min,A:80%;10～15 min,A:80%;15～25 min,A:50%;25～30 min,A:40%。检测波长520 nm;流速1 mL/min;恒温柱箱温度30 ℃;进样体积5 μL;波长扫描210～700 nm。

1.2.2.2 质谱条件 采用正离子模式;电压3.5 kV;CDL温度200 ℃;加热部件200 ℃;雾化气(N2)1.5 L/min;干燥气压(N2)0.1 MPa。一级质谱离子扫描范围m/z 200～1500;二级质谱离子扫描范围m/z 100～1500;三级质谱离子扫描范围m/z 50～1500。使用自动模式搜集数据,氩气作为碰撞气体,二级和三级质谱能量设置均为50%。

1.2.3 化合物鉴定 参考Lv等[26]的方法,通过HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn测试,获取相关数据,对6种蓝莓提取液中的花青素结构及种类进行鉴定。

花青素组分在210～550 nm UV波长范围内存在两种主要吸收,吸收带Ⅰ为270～280 nm,吸收带Ⅱ为520～530 nm。基于DAD紫外光谱扫描,筛选出具有花青素特征吸收的化合物。

确定具有花青素UV特征光谱的组分对应的母离子的准确分子量。

通过Formula Predictor 4.2软件检索花青素化合物的分子式。为确保预测化合物的分子式准确性,测量的分子离子与预测分子式之间的质量差异应低于5 ppm。

根据花青素化合物的质谱裂解规律,确定组分的糖苷配基类型、糖基类型及糖基取代类型,从而推测出蓝莓花青素结构。

1.3 数据处理

所有实验重复测定三次,采用Origin 8.5进行绘图。

2 结果与分析

2.1 六种蓝莓花青素结构分析

利用Formula Predictor 4.2软件对6种不同品种的蓝莓提取液中的花青素结构进行检索,得到5种不同的苷元结构,如下图1所示。

图1 五种游离花青素的分子结构

2.1.1 以矢车菊素为苷元的花青素 矢车菊素(Cyanidin)在苷元上3、5、7、4′、5′位连接五个羟基而成,质谱分析得到离子碎片基峰为m/z 287;6种蓝莓中均鉴定出矢车菊素。

2.1.2 以花翠素为苷元的花青素 花翠素(Delphinidin)在矢车菊素的基础上3′位多链接一个羟基,质谱分析得到离子碎片基峰为m/z 303,特征离子包括m/z 262、m/z 172;6种蓝莓中均鉴定出花翠素。在蓝莓提取液中还测得两种具有典型的花青素类化合物UV光谱图的物质,分析这两类化合物的MS及MS/MS数据。其中一种化合物与花翠素苷元的分子离子相比,其分子量相差大约为162,由Formula Predictor 4.2软件推测该化合物与花翠素相差1个[C6H10O5]单糖单元,经查阅文献鉴定该花青素为花翠素-3-O-半乳糖配基[29],测得埃利奥特蓝莓、北陆蓝莓、杜克蓝莓含有该类化合物。另一种化合物与花翠素的分子离子相比,其分子量相差大约为132,由软件推测该化合物与花翠素相差1个脱水的[C5H8O4]单糖单元,经查阅文献得该花青素为花翠素-3-O-阿拉伯糖配基[29],测得含有该花青素的蓝莓品种是埃利奥特、爱国者、北陆、蓝丰。

2.1.3 以牵牛花色素为苷元的花青素 牵牛花色素(Petunidin)在苷元上3、5、7、3′、4′位连接五个羟基,4′位连接一个甲氧基而成,质谱分析得到离子碎片基峰为m/z 317,特征离子包括m/z 302、m/z 274;6种蓝莓中检测到牵牛花色素的有埃利奥特蓝莓、爱国者蓝莓、北蓝蓝莓、北陆蓝莓、杜克蓝莓。

在蓝莓提取液中还检测到两种具有典型的花青素类化合物UV光谱图的物质,分析这两类化合物的MS及MS/MS 数据。第一种物质与牵牛花色素的分子离子相比,其分子量相差大约162,由软件推测该化合物与牵牛花色素相差1个[C6H10O5]单糖单元,查阅文献鉴定该花青素为牵牛花色素-3-O-半乳糖配基或牵牛花色素-3-O-葡萄糖配基[29],但由于两种物质出峰时间不同,牵牛花色素-3-O-半乳糖配基色谱峰的保留时间早于牵牛花色素-3-O-葡萄糖配基色谱峰,因此,此化合物为牵牛花色素-3-O-半乳糖配基,测得含有此化合物的蓝莓品种有:北蓝蓝莓、北陆蓝莓、丰蓝蓝莓。另一种化合物与牵牛花色素的分子离子相比,其分子量相差大约为132,由软件推测出的化合物分子式与牵牛花色素相差1个脱水的[C5H8O4]单糖单元,查阅文献得该物质为牵牛花色素-3-O-阿拉伯糖配基[29],该花青素在埃利奥特、爱国者、北陆、杜克蓝莓中可检测到。

2.1.4 以芍药素为苷元的花青素 芍药素(Peonidin)则在苷元上3、5、7、4′位连接四个羟基,5′位连接一个甲氧基而成,质谱分析得到离子碎片基峰为m/z 301,特征离子包括m/z 286、m/z 258;6种蓝莓中检测出芍药素的品种是埃利奥特蓝莓、爱国者蓝莓。

2.1.5 以锦葵色素为苷元的花青素 锦葵色素(Malvidin)在苷元上3、5、7、4′位连接四个羟基,3′、5′位连接两个甲氧基而成,质谱分析得到离子碎片基峰为m/z 331,特征离子包括m/z 299、m/z 287。6种蓝莓中检测出锦葵色素的品种是:埃利奥特、爱国者、北陆、杜克、北蓝。

在蓝莓提取液中还测得一些具有典型的花青素类化合物UV光谱图的物质,对这些化合物的MS及MS/MS数据进行分析。第一种化合物与锦葵色素的分子离子相比,其分子量相差大约162,由软件推测该化合物与锦葵色素相差1个[C6H10O5]单糖单元,查阅文献得该花青素为锦葵色素-3-O-半乳糖配基或锦葵色素-3-O-葡萄糖配基[29],但由于两个物质出峰时间不同,锦葵色素-3-O-半乳糖配基先于锦葵色素-3-O-葡萄糖配基出峰,故鉴定出峰早的化合物为锦葵色素-3-O-半乳糖配基,出峰晚的化合物锦葵色素-3-O-葡萄糖配基,检测出含有锦葵色素-3-O-半乳糖配基的蓝莓品种是埃利奥特、爱国者、北陆、杜克、北蓝;含有锦葵色素-3-O-葡萄糖配基的品种是北陆、杜克、丰蓝。另一种物质与锦葵色素的分子离子相比,其分子量相差大约132,由软件推测该化合物与锦葵色素相差1个脱水的[C5H8O4]单糖单元,查阅文献得该花青素为锦葵色素-3-O-阿拉伯糖配基[29],鉴定出含有该花青素的种类为埃利奥特、爱国者、杜克、北蓝、丰蓝。

2.2 六种蓝莓花青素结构鉴定

6种不同品种蓝莓中的花青素通过HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn被分析鉴定出来,根据上述分析,将不同品种蓝莓提取液的液相总离子流图,以及鉴定出的花青素种类和它们对应的化合物UV 光谱数据、一级质谱数据、二级质谱数据汇总,如表1～表6所示,不同蓝莓品种的色谱图如图2～7所示。

图2 埃利奥特蓝莓花青素提取物的色谱图

图3 爱国者蓝莓花青素提取物的色谱图

图4 北蓝蓝莓花青素提取物的色谱图

图5 北陆蓝莓花青素提取物的色谱图

图6 杜克蓝莓花青素提取物的色谱图

图7 蓝丰蓝莓花青素提取物的色谱图

表1 埃利奥特蓝莓花青素提取物HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn数据及化合物鉴定结果

表2 爱国者蓝莓花青素提取物成分特性

表3 北蓝蓝莓花青素提取物成分特性

表4 北陆蓝莓花青素提取物成分特性

表5 杜克蓝莓花青素提取物成分特性

表6 蓝丰蓝莓花青素提取物 成分特性

2.3 不同品种蓝莓花青素组成

将6个品种的蓝莓检测到的花青素种类归纳,埃利奥特蓝莓共测得11种花青素,爱国者蓝莓10种,北蓝蓝莓7种,北陆蓝莓12种,杜克蓝莓9种,蓝丰蓝莓6种。由图8可知,北陆蓝莓检测到的花青素种类最多,达12种;埃利奥特和爱国者蓝莓中检测到的花青素种类也很丰富,分别达到11和10种;蓝丰蓝莓中检测到6种。

图8 不同品种蓝莓花青素个数对比

从花青素的组成上看,由表7可知,花翠素和矢车菊素这两种花青素在6种蓝莓中均被检出;带糖配基的锦葵色素-3-O-半乳糖配基、锦葵色素-3-O-阿拉伯糖配基、牵牛花色素以及锦葵色素在埃利奥特、爱国者、北蓝、北陆、杜克5种蓝莓中均检测到;蓝丰蓝莓中未检测到锦葵色素-3-O-半乳糖配基,牵牛花色素和锦葵色素;锦葵色素-3-O-阿拉伯糖配基在北蓝蓝莓中没有检测到;芍药素只在埃利奥特和爱国者蓝莓中被检测出来。

表7 不同品种蓝莓花青素组成

3 结论

本文利用HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn对埃利奥克、爱国者、北蓝、北陆、杜克、蓝丰6种不同品种的蓝莓花青素进行对比分析,结合紫外可见光谱及多级质谱数据对花青素的结构进行鉴定,建立了一种实用、快速且准确鉴定蓝莓花青素种类的多级质谱液质联用方法。

蓝莓的品种不同,含有的花青素种类、结构均存在显著差异。从花青素种类分析,6种蓝莓中共测得花青素13种,其中北陆中检测到的花青素种类最多,共12种,包括花翠素、矢车菊素、牵牛花色素、锦葵色素4种花青素苷元以及花翠素、牵牛花色素、锦葵色素与糖基的衍生物8种;埃利奥特和爱国者的花青素种类也较为丰富,分别测得11种和10种,包括花翠素、矢车菊素、牵牛花色素、锦葵色素、芍药素5种花青素苷元以及花翠素、牵牛花色素、锦葵色素与糖基的衍生物;北蓝蓝莓测得7种,杜克蓝莓鉴定出9种,蓝丰蓝莓中检测到的种类较少,只有6种。从花青素的组成分析,以不联接糖苷的花翠素和矢车菊素在蓝莓中分布最广泛,所有品种中均可检测到。除花翠素、矢车菊素外,不联接糖苷的锦葵色素和牵牛花色素以及带有糖配基的锦葵色素-3-O-阿拉伯糖配基和锦葵色素-3-O-半乳糖配基也分布较广。其中不联接糖苷的锦葵色素和牵牛花色素以及锦葵色素-3-O-半乳糖配基在除蓝丰品种外的其它5个品种中均检测到,带有糖配基的锦葵色素-3-O-阿拉伯糖配基可在埃利奥克、爱国者、北陆、杜克、蓝丰5个蓝莓品种中检测到。含有芍药素的蓝莓品种较少,只在埃利奥克、爱国者品种中检测到。

蓝莓花青素与其他植物的花青素相比,具有小分子、更易吸收的优点,同时因其出色的保健功能,成为近年来研究者和蓝莓产品市场的关注热点。目前针对多品种蓝莓花青素结构及种类的研究较少,本文章利用HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn技术建立的分析测试方法可以快速、准确地鉴定出蓝莓花青素种类,亦可为选育花青素种类丰富的蓝莓品种及后续蓝莓花青素产品的开发与深加工提供数据参考。