杨德翠,徐 青,赵方贵,柳 冕,刘 新

(1.青岛农业大学 生命科学学院,山东省高校植物生物技术重点实验室,山东 青岛 266109； 2.武汉海稻国际生物科技有限公司,湖北 武汉 430000)

盐胁迫对植物氮代谢的影响在分子水平上也初步进行研究,Lü 等[10]研究了鳗草在NaCl胁迫下的转录组,发现盐胁迫后鳗草的NR、NiR基因表达显著上调。相比盐胁迫下氮代谢酶活性的研究,氮代谢相关基因在盐胁迫后的表达变化报道较少。

水稻是重要的粮食作物,盐胁迫下氮代谢调节机制将对整个生命活动起到重要作用,但盐胁迫下氮代谢整个过程的研究还不够系统、深入,特别是不同抗性品种氮代谢相关基因在盐胁迫下差异表达有待研究。

1 材料和方法

1.1 试验材料及培养

1.1.1 试验材料 试验选用抗性粳稻(Oryzasativasubsp. Keng)品种东稻4号以及盐敏感品种日本晴(OryzasativaL.spp.japonica)。

将水稻种子用0.1%的HgCl2消毒10 min,用蒸馏水冲洗3～4次,于蒸馏水中浸泡12 h,然后将种子置于培养皿中,在28 °C恒温培养箱中催芽萌发。

将萌发后种子置于96孔板中进行水培,培养液为1/4 Hoagland营养液(pH值6.0),光周期/黑暗为14 h/10 h,温度29 ℃/25 ℃。培养12 d后进行盐胁迫处理。

1.1.2 试验材料的处理 青岛农业大学植物生理实验室前期试验表明,在0.3%的NaCl胁迫下2个水稻品种有显著差异,因此,盐处理液用1/4 Hoagland营养液配制成0.3%的NaCl溶液,对照组为1/4 Hoagland营养液。每天更换一次培养液。处理24 h,取根和叶用于基因的检测；4 d后,对水稻幼苗叶和根进行取样,用于相关生理指标的测定,所取材料保存于-80 ℃超低温冰箱中。

1.2 试验方法

1.2.1 氮相关物质含量的测定 铵态氮含量测定采用茚三酮显色法[11],硝态氮含量测定采用水杨酸-硫酸显色法[12]。

1.2.2 氮代谢相关酶活性的测定 硝酸还原酶活性参照施晟璐等[13]的方法,谷氨酰胺合成酶GS活性测定参照刘丽等[14]的方法；谷氨酸合成酶NADH-GOGAT及谷氨酸脱氢酶GDH活性测定,参照林清华等[15]的方法；谷氨酸合成酶Fd-GOGAT的测定参照滕祥勇[16]的方法；天冬氨酸转氨酶AST活性测定参照梁成刚等[17]的方法。

1.2.3 氮代谢基因表达量测定 采用改良TRIzol法提取总RNA[18]。利用实时荧光定量PCR技术检测氮代谢相关基因,包括硝酸根转运蛋白基因OsNRT1;1、OsNRT1;5、OsNRT1;8和OsNRT2;1,铵转运蛋白基因OsAMT1;1和OsAMT1;2,硝酸还原酶基因OsNR1,谷氨酰胺合成酶基因OsGS1;2及谷氨酸合酶基因OsNADH-GOGAT和OsFd-GOGAT以及天冬氨酸转氨酶基因OsAS。水稻基因名称和引物设计见表1。PCR扩增程序为:95 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40个循环；从72 ℃至99 ℃,第1步维持45 s,以后每升高1 ℃维持5 s,按2-ΔΔCT方法计算。

表1 基因定量表达引物序列Tab.1 The primers sequences for quantitative expression of genes

1.3 数据统计和分析

所有试验数据至少3次重复,用Excel数据处理系统作图,用SAS V8对测定结果进行显著性分析,不同小写字母的差异代表在P<0.05水平上显著。

2 结果与分析

2.1 NaCl胁迫对不同抗性水稻氮含量的影响

不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。图2-7同。 Different lowercase letters represents significant difference among treatments(P<0.05).The same as Fig.2-7。

2.2 NaCl胁迫对不同抗性水稻硝酸还原酶(NR)活性的影响

2.3 NaCl胁迫对不同抗性水稻氨同化相关酶活性的影响

图2 NaCl胁迫下不同品种水稻根和叶中NR活性的变化Fig.2 Changes of nitrate reductase activity in roots and leaves of different rice varieties under NaCl stress

图3 NaCl胁迫下不同品种水稻根和叶中氨同化相关酶活性的变化Fig.3 Changes of ammonium assimilation enzymes in roots and leaves of different rice varieties under NaCl stress

2.4 NaCl胁迫对不同抗性水稻氮代谢相关基因相对表达量的影响

图4 NaCl胁迫下不同品种水稻根和叶中硝酸盐转运蛋白基因(OsNRTs)相对表达量的变化Fig.4 Changes of OsNRTs relative expression in roots and leaves of different rice varieties under NaCl stress

图5 NaCl胁迫下不同品种水稻根和叶中铵态氮转运蛋白(OsAMTs)基因相对表达量的变化Fig.5 Changes of OsAMTs relative expression in roots and leaves of different rice varieties under NaCl stress

图6 NaCl胁迫下不同品种水稻根和 叶中硝酸还原酶基因相对表达量的变化Fig.6 Changes of OsNR1 relative expression in roots and leaves of different rice varieties under NaCl stress

3 讨论

图7 NaCl胁迫下不同品种水稻根和叶中氨同化相关酶基因表达量的变化Fig.7 Changes of relative expression of genes involved in ammonium assimilation in roots and leaves of different rice varieties under NaCl stress

对氮代谢相关基因表达量进行研究,Cai等[30]发现,谷氨酰胺合成酶基因OsGS1;2过表达突变体能增强对非生物胁迫的抵抗能力。本研究表明,OsGS1;2在NaCl胁迫后显著升高,与王欢[25]研究结果较一致。主要在根部表达的谷氨酸合酶基因OsNADH-GOGAT和在叶部表达的OsFd-GOGAT盐胁迫后都升高,以保持在盐胁迫下的GOGAT酶活性,东稻4号OsGS/OsFd-GOGAT表达量在胁迫条件下均高于日本晴,这与东稻4号GS/GOGAT酶活性高于日本晴相一致,同时升高表达量的还有OsAS基因,而Wang等[24]发现,水稻不同抗性品种在盐碱胁迫后OsNADH-GOGAT、OsFd-GOGAT、OsAS都有显著降低。

本研究中根和叶部酶活性变化基本一致,不同基因在不同部位表达存在差异,但结果也表明,品种抗性与氮代谢相关基因表达量密切相关,也为进一步研究盐胁迫下氮代谢相关基因提出了必要性。

综合来看,抗性品种东稻4号在盐胁迫下保持了较高的氮代谢酶活性及较稳定的氮代谢方式,这也许是抗性水稻耐盐的一个重要原因。