金东梅，李天禹，宋传鹏

(1.遵义医科大学附属医院 康复医学科，贵州 遵义 563099; 2.遵义医科大学附属医院 中医科，贵州 遵义 563099; 3.邹城市人民医院 神经内科，山东 邹城 273500)

多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome，PCOS)是育龄期女性常见的内分泌疾病之一，常表现为稀发排卵或无排卵、高雄激素血症、月经失调、不孕及卵巢多囊改变，常伴有胰岛素抵抗和肥胖等症状，在育龄期妇女发病率为6%～10%，其中的34.1%～43.3%伴有肥胖体征[1-3]。目前对于PCOS的发病机制仍不明确，治疗效果欠佳。根据PCOS症状特点及体征表现，在中医分型中主要为痰湿型，在动物造模研究中以肥胖、胰岛素抵抗模拟痰湿型PCOS模型。结合加味启宫丸(Modified Qigong Pill,MQP)在临床上治疗痰湿型PCOS患者收到理想效果[4-5]，拟研究MQP对肥胖型PCOS模型小鼠血清卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone,FSH) 、促黄体生成激素(Luteinizing hormone,LH) 的干预作用，及对卵巢组织的修复作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲料 56只SPF级、23日龄雌性KM小鼠，体质量(20.06±1.15)g，购买于中国人民解放军第三军医大学实验动物中心(许可证号：SCXK(军)2012-0011)。将所有小鼠置于遵义医科大学动物实验中心(许可证号：SCXK(黔)2018-0002)、屏障环境内喂养。饲养条件为恒温(20±2)℃，相对湿度(65±15)%，每日光照12 h，普通饲料适应性喂养2 d。高脂高糖饲料(购自遵义医科大学动物实验中心)。

1.2 实验试剂与仪器 硫酸脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone,DHEA)、注射用大豆油、链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)、柠檬酸钠缓冲液(均购自源叶生物有限公司)，FSH放射免疫试剂盒(【批准文号】国药准字S10950154，批号：20180920)、LH放射免疫试剂盒(【批准文号】国药准字S10950161，批号：20180918)(均购自北京北方生物技术研究所有限公司)。MQP组方(白芍10 g、苍术10 g、枸杞10 g、车前子10 g、当归10 g、炒白术15 g、茯苓15 g、法半夏10 g、川芎10 g、陈皮10 g、炒山楂10 g、神曲10 g、薏苡仁10 g、菟丝子15 g、牛膝10 g、香附15 g，生药由遵义医科大学附属医院中药房提供，由遵义医科大学附属医院生药教研室杨建文教授鉴定，均为正品。并由遵义医科大学药理实验室协助煎煮、过滤，浓缩至每1 mL相当于生药18 g)。BX53显微镜(OLYMPUS)，MJN-681C电子天平(甬衡电子衡器有限公司)，SW-CJ-1B超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，GC-2010γ放射免疫计数器(科大创新股份有限公司中佳分公司)。

1.3 方法

1.3.1 动物建模与分组 将56只小鼠按随机数字表法分为正常组13只，造模组43只，43只造模组小鼠按邢佳等[6]的造模方法予以高脂高糖饲料喂养同时每只小鼠颈背部皮下注射9 mg/100 g DHEA油溶液0.1 mL，连续20 d后，禁食12 h，予腹腔注射120 mg/kg STZ 柠檬酸钠溶液 0.1 mL/10 g 1次，继续高脂高糖饲料喂养14 d。第15日，禁食12 h后，在正常组及造模组中随机选取3只小鼠，用放射免疫法检测到造模组小鼠血清LH水平、FSH水平与正常组小鼠血清LH、FSH水平不一致，用H&E染色显微镜观察造模组小鼠卵巢组织学与正常组小鼠组织学检查有区别，即判断造模成功。小鼠造模成功后，将40只造模组小鼠分为PCOS对照组10只、MQP低剂量组(MQP-L)10只、MQP中剂量组(MQP-M)10只、MQP高剂量组(MQP-H)10只。

1.3.2 加味启宫丸干预 正常组、PCOS对照组、MQP-L、MQP-M、MQP-H各组均予以常规饲料喂养、每日分别灌服蒸馏水0.3 mL、蒸馏水0.3 mL、11.57 g/kg MQP 0.3 mL、23.14 g/kg MQP 0.3 mL、46.28 g/kg MQP 0.3 mL，连续灌服15 d。

1.3.3 指标检测及方法 药物干预15 d，禁食12 h后称量各组小鼠体质量，断头取血法处死小鼠并采集标本。用放射免疫分析法测定小鼠血清中的FSH、LH含量(操作步骤按试剂盒说明书进行)。摘取小鼠卵巢组织，制作石蜡切片，H&E染色后，在光学显微镜下比较各组小鼠卵巢组织形态。

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况比较 正常组小鼠毛色白亮柔顺，胡须细密，对外界刺激反应灵敏，动作迅速。造模结束后造模组小鼠毛色晦暗，对外界刺激反应较迟钝，胡须变粗，细密度减少，动作迟钝，活动较少。用药后，MQP-L、MQP-M小鼠毛色较用药前柔顺，活动较用药前增多，反应较用药前灵敏；MQP-H小鼠毛色暗淡无明显改善，对外界刺激无明显反应，进食等动作较迟钝。

2.2 各组小鼠体质量比较 PCOS对照组体质量明显增加，明显高于正常组，组间有显著差异(P<0.05)；MQP-L组、MQP-M组体质量也有增加，与PCOS对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；MQP-H体质量与正常组、PCOS对照组、MQP-M体质量组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.3 各组小鼠血清激素水平比较 PCOS对照组小鼠血清LH水平明显高于正常组及各MQP干预组，且与正常组及各干预组之间比较，血清LH水平的差异均有统计学意义(P<0.05)。MQP-L组、MQP-M组、MQP-H组小鼠之间血清LH水平差异均无统计学意义(P>0.05)。PCOS对照组小鼠血清FSH含量明显低于正常组及各MQP干预组，且与正常组和各干预组比较，血清FSH水平的差异均有统计学意义(P<0.05)。MQP-L组与MQP-M组、MQP-H组小鼠之间血清FSH水平差异均有统计学意义(P<0.05，见表1)。MQP-L、MQP-M、MQP-H的LH值、FSH值与给药剂量无明显相关性(rs=-0.266，P>0.05；rs= 0.126，P>0.05)。

组别干预后体质量(g)LH(mIU/mL) FSH(mIU/mL)正常24.95±1.7163.77±2.67 2.53±0.17PCOS对照34.40±1.16∗329.57±9.58∗1.87±0.29∗MQP-L33.83±0.49∗72.60±0.89# 3.95±0.69#MQP-M34.40±1.57∗68.13±3.52# 2.87±0.28#★MQP-H31.85±1.17∗#▲79.85±13.31#3.24±0.50#★

与正常组比较，*：P<0.05；与PCOS对照组比较，#：P<0.05；与MQP-L比较，★：P<0.05；与MQP-M比较，▲：P<0.05。

2.4 各组小鼠卵巢组织形态比较 PCOS对照组卵泡多呈囊性扩张，原始卵泡增多，颗粒层细胞排列稀疏，层数为4～5层，黄体数量减少。与PCOS对照组相比，MQP-L小鼠原始卵泡数量减少，可见成熟卵泡和少量黄体，颗粒细胞数增加，为6～7层。MQP-M原始卵泡及次级卵泡较多，卵泡囊性扩张减少，颗粒层细胞比较整齐，层数5～6层，可见黄体。MQP-H原始卵泡及次级卵泡明显增多，优势卵泡形成，颗粒层细胞排列整齐紧密，为4～5层，黄体组织较少(见图1)。

A、A1:正常组; B、B1:PCOS对照组; C、C1:MQP-L; D、D1:MQP-M; E、E1:MQP-H;下一栏图为上一栏图中实线箭头处放大到400倍时的镜下观(A、B、C、D、E ×100，A1、B1、C1、D1、E1 ×400)。图1 各组小鼠卵巢组织形态学

3 讨论

PCOS发病机制可能和下丘脑-垂体-卵巢轴功能异常、自主神经功能紊乱及肥胖、遗传、环境、心理因素等有关[7-10]。

中医学理论认为PCOS病位在肾，与肝、脾二脏功能失调有关。脾虚失却运化，水湿内停，痰浊内壅，阻滞宫胞，干扰肾气-天癸-冲任-胞宫生殖轴，涉及胎孕。临床上采用燥湿化痰方剂如苍附导痰汤等治疗[11-12]。已有研究，化痰法可改善PCOS患者月经周期，降低其体质量[13]，可上调PCOS模型大鼠的肝脏组织、卵巢黄素化颗粒细胞胰岛素受体底物-1、卵巢黄素化颗粒细胞胰岛素受体底物-2 mRNA和蛋白表达水平，减轻PCOS大鼠体质量和卵巢质量[14-15]。

“加味启宫丸”主治痰湿阻滞，兼夹脾肾虚弱、肝阴不足之证。方中炒白术、苍术、法半夏、陈皮健脾燥湿；茯苓、薏苡仁除湿和中；白芍、当归养血敛阴；菟丝子、枸杞子走肝、脾、肾经，滋肝补肾；牛膝归肝、肾经，引血下行；车前子入足厥阴以行血，入足太阳以利水，与牛膝相配引血下行，使湿浊得利，宫胞得充；香附、炒山楂、神曲理气消滞；川芎散郁和血，冲任气血调和，利于受孕。

运用DHEA联合高脂高糖饲料及STZ诱导建立肥胖型PCOS小鼠模型，造模组小鼠体质量明显升高，高LH血症，卵巢囊性扩张的卵泡数较多，颗粒细胞层变薄甚至消失，卵巢呈多囊样改变，符合PCOS的特征性变化，结果与邢佳和李燕报道一致[6,16]，表明造模成功。过食高脂高糖饲料则困遏脾土，脾失健运，湿浊内生，气机阻滞，酿湿生痰，故表现为肥胖等，即模型小鼠体质量增加。MQP干预后，MQP-H组小鼠体质量显著降低，且与PCOS对照组小鼠之间差异明显，而PCOS对照组与MQP-L、MQP-M小鼠之间比较无明显差异，表明MQP调节肥胖型PCOS小鼠体质量可能与其浓度相关。MQP中炒白术健脾运湿，配苍术燥湿健脾，加陈皮、法半夏化痰除湿，佐牛膝归肝、肾经，引血下行，表现为改善肥胖型PCOS小鼠的体质量，具体有效剂量阈值及作用机制有待进一步研究。

垂体FSH/LH分泌紊乱，导致卵巢间质细胞及卵泡细胞增生，分泌功能异常等，使卵泡成熟障碍、排卵障碍，最终使卵巢呈多囊样改变[17]。去除痰湿方法可改善PCOS患者LH、睾酮(T)水平及LH/FSH比值，并增加子宫内膜容受性及外周组织对胰岛素的敏感性，改善胰岛素抵抗[18-19]。本实验结果显示，各治疗组小鼠卵巢形态都比PCOS对照组更接近于正常，表明MQP对肥胖型PCOS模型小鼠卵巢形态有改善作用。PCOS实验组小鼠胡须粗经MQP干预后得到一定程度改善，考虑可能与血清LH降低有关。各MQP干预组与肥胖型PCOS对照组相比，LH明显降低，FSH明显升高，提示MQP可改善小鼠血清LH、FSH水平，但改善程度与用药剂量无明显相关关系，需进一步研究以明确有效阈值剂量及作用机制，同时为确保MQP安全性，拟将研究MQP药物副作用、毒性反应等。

综上所述，MQP可有效降低肥胖型PCOS模型小鼠体质量、血清LH水平，提高血清FSH水平，改善模型小鼠卵巢组织形态。