高勇强，李春鸣，邹盛楠，梁 娜，张 萌，何晓凤

(1.遵义医科大学附属医院 病理科，贵州 遵义 563099；2.遵义医科大学第二附属医院 病理科，贵州 遵义 563099；3.遵义医科大学 组织胚胎学教研室，贵州 遵义 563099；4.遵义医科大学 研究生院，贵州 遵义 563099)

胃癌是全世界最常见的消化系统肿瘤之一，位居消化道肿瘤的首位[1-2]，是全球第三大死亡原因[3]；据世界卫生组织报道，胃癌发病率最高的地区为东亚，且治愈率偏低。由于大多数胃癌早期无明显症状，多数患者就诊时已处于疾病进展期，发生全身多处转移或局部浸润，往往失去手术根治机会。因此，寻找胃癌细胞侵袭及转移的机制，探索潜在的胃癌基因治疗靶点就显得尤为重要。

KAI1基因是近年来研究较多的一个肿瘤转移抑制基因，最初是在前列腺癌研究中被发现，近年来多数研究表明，它可以通过调节细胞之间的粘附、抑制细胞的运动、诱导细胞的衰老与凋亡等方式来抑制多种肿瘤细胞的转移与侵袭。本课题组前期已筛选出KAI1高表达胃癌细胞株MKN28及低表达细胞株BGC823[4]。本研究将承接课题组前期试验，通过慢病毒转染方法将BGC823胃癌细胞株中低表达的KAI1基因过表达，将MKN28胃癌细胞株中高表达的KAI1基因沉默，并建立两种细胞的稳转细胞株。通过Western blot、RT-PCR方法检测转染效果，再进一步结合体外MTT、Transwell等实验分析KAI1基因对胃癌细胞的体外生长迁移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 研究对象 ①细胞株：低表达KAI1基因人胃癌细胞BGC823；高表达KAI1基因人胃癌细胞MKN28，由遵义医科大学病理学教研室保存。②慢病毒载体：过表达载体pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-KAI1-3Flag和RNA干扰载体pCMV-EGFP-2A-Puro-U6-shRNA(KAI1)购自上海和元生物公司。

1.2 主要试剂 FBS胎牛血清、DMEM培养基购自Gibco公司；兔抗人KAI1单克隆抗体购自美国Abcam公司；鼠抗人Tubulin单克隆抗体、逆转录试剂盒、扩增试剂盒购自北京全式金生物； MTT试剂盒、细胞周期试剂盒、Western blot相关试剂购自Solarbio公司，超敏ECL化学发光底物购自Millipore公司；KAI1、Actin正反向引物由北京擎科生物科技有限公司合成；Transwell小室(24孔板)购自美国康宁。

1.3 主要设备及仪器 超净工作台(苏州净化设备有限公司)、MHG-100B型荧光显微镜(日本 Olympus公司)、低温高速离心机(德国EPPendorf Centrifuge公司)、MULTISKAN GO酶标仪(美国Thermo公司)、实时定量 PCR 仪、蛋白曝光系统(美国 BIO-RAD公司)、流式细胞仪(德国Beckman公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养 配置含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养基将人胃癌BGC823细胞、人胃癌MKN28细胞置于37℃恒温、5%CO2孵箱中培养，1～2 d换液1次，待观察细胞贴壁长至80%以上时进行胰酶消化传代培养。

1.4.2 构建慢病毒稳定转染细胞株 将状态良好的BGC823、MKN28细胞以5×104个/孔的密度铺于24孔板中，每孔500 μL完全培养基，继续培养24 h。根据预实验筛选出的两种细胞慢病毒感染最佳MOI值(BGC823细胞10、MKN28细胞40)，将慢病毒原液用含有10%胎牛血清的DMEM培养基稀释并加入终浓度为5 μg/mL的polybrene。吸弃24孔板中的培养基，将两种细胞各分为3组，每孔加入含有目的基因载体的病毒原液培养基为实验组(OE组)；加入含有空载体病毒原液的培养基为阴性对照组(NC组)；加入不含有病毒原液的培养基为空白对照组(Ctrl组)。孵育24 h后更换完全培养基，每天换液。病毒感染72 h后每日在荧光显微镜下观察细胞，根据荧光强弱判断慢病毒感染目的细胞的效率，当感染率达到80%时，更换含有最佳致死浓度(1 μg/mL)嘌呤霉素的完全培养基继续培养，每日换液并加入新鲜的嘌呤霉素。待Ctrl组中的细胞完全死亡时，扩增OE组和NC组即得到稳转的细胞系。

1.4.3 RT-PCR检测稳转细胞中KAI1mRNA表达 收集BGC823、MKN28各组细胞，按照RNA抽提试剂盒说明书进行总RNA的提取，并进行浓度及纯度测定。根据反转录试剂盒说明书进行操作将RNA逆转录为cDNA。再以cDNA为模板，用两步法进行荧光定量PCR，共40个循环(95℃ 3min， 95℃ 10s，55℃ 30s)，2-△△Ct法相对定量分析，各组重复4次。KAI1及内参Actin引物如下：KAI1上游：5′-TGTCCTGCAAACCTCCTCCA-3′；KAI1下游：5′-CCATGAGCATAGTGACT GCCC-3′；Actin上游：5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′；Actin下游：5′-GGGCC GGACTCGTCATAC-3′。

1.4.4 Western blot检测稳转细胞中KAI1蛋白表达 将处在对数生长期的BGC823、MKN28各组细胞中加入预冷的PIPA裂解液，裂解细胞制备成匀浆，4℃离心取上清，用BCA法测定各蛋白样品浓度，调整各样品为相同浓度，加入5×上样缓冲液，沸水中煮5min使蛋白变性，将变性蛋白用SDS-聚丙烯酰胺电泳进行分离，每孔上样量为10 μL，再将分离后的蛋白转移到PVDF膜，使用BSA封闭转好的膜2 h，加入KAI1一抗(兔抗人一抗按1∶1 000倍数稀释)4℃孵育过夜，次日用1×TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗(羊抗兔二抗1∶10 000倍数稀释)常温摇床孵育1.5 h，1×TBST洗膜3次，每次15分钟。进行化学发光显影曝光，并用凝胶成像系统拍照。通过解析条带灰度值，对KAI1蛋白进行结果分析，以β-tubulin为内参照。

1.4.5 MTT检测KAI1基因对胃癌细胞增殖的影响 用胰酶消化BGC823、MKN28各组细胞，以每孔5×103个细胞、体积100 μL的标准加入到96孔板中，每组设置3个复孔。观察到细胞贴壁后，分别于第0、24、48、72小时在每孔中加入20 μL浓度为5 mg/L的MTT溶液，继续孵育4 h后吸取上清液，在每孔中加入100 μL DMSO溶液，振荡10 min使结晶物充分溶解。酶标仪测490 nm波长处各孔吸光度值，计算各组细胞的相对增殖率。

1.4.6 Transwell检测KAI1基因对胃癌细胞迁移的影响 用胰酶消化BGC823、MKN28各组细胞，用无血清培养基悬浮细胞并调整细胞浓度，每个Transwell上室中加入200 μL的5×104个细胞，下室加入550 μL的含10%胎牛血清的培养基，放入孵箱中继续培养24 h；第2天小心取出小室，PBS清洗晾干后，用多聚甲醛室温固定30 min；再用结晶紫室温染色15 min，清水清洗后晾干、切膜，放入载玻片上用中性树胶封片，显微镜下随机选取5个视野用IPWIN32计数。

1.4.7 流式细胞术检测KAI1基因对胃癌细胞周期的影响 用胰酶消化离心收集BGC823、MKN28各组细胞，PBS清洗，调整细胞浓度为1×106个/mL，取1 mL单细胞悬液，再次离心去除上清，加入预冷的70%乙醇500 μL固定4℃保存过夜。次日取出固定后的细胞离心清洗，在细胞沉淀中加入100 μLRNase A溶液，重悬细胞，37℃水浴30 min，再加入400 μL PI染色液，混匀，4℃避光孵育30 min后上机检测。

2 结果

2.1 BGC823、MKN28细胞各组的感染情况 病毒感染72 h后荧光显微镜下观察细胞，根据荧光强弱判断慢病毒感染率达到80%，每组更换含有最佳致死浓度(1 μg/mL)嘌呤霉素的完全培养基继续培养，至Ctrl组中的细胞完全死亡时，扩增筛选后的细胞如图1所示。

A:BGC823-Ctrl组;B:BGC823-NC组;C:BGC823-OE组;D:MKN28-Ctrl组;E:MKN28-NC组;F:MKN28-OE组。图1 筛选稳定转染细胞收样图

2.2 各组细胞KAI1mRNA表达变化 BGC823-OE组KAI1mRNA的相对表达量明显高于NC组与Ctrl组，差异具有统计学意义(P<0.05)，NC组与Ctrl组比较差异无统计学意义(P>0.05)；MKN28-OE组的KAI1 mRNA的相对表达量明显低于NC组与Ctrl组，差异具有统计学意义(P<0.05)，NC组与Ctrl组比较差异无统计学意义(P>0.05)，与蛋白的相对表达结果相一致(见图2)。

*：与NC组比较，P<0.05；#：与Ctrl组比较，P<0.05。图2 KAI1mRNA在BGC823、MKN28细胞各组中的相对表达量

2.3 各组细胞KAI1蛋白水平 人胃癌BGC823-OE组KAI1蛋白的相对表达量明显高于NC组与Ctrl组，差异具有统计学意义(P<0.05)，NC组与Ctrl组比较差异无统计学意义(P>0.05)；人胃癌MKN28-OE组KAI1蛋白的相对表达量明显低于NC组与Ctrl组，差异具有统计学意义(P<0.05)，NC组与Ctrl组比较差异无统计学意义(P>0.05,见图3)。

2.4 KAI1过表达和沉默对胃癌细胞增殖的影响 分别于各组细胞在培养第0、24、48、72小时时加入MTT试剂并检测光密度值，将各组0h的光密度值作为标准，计算出各个时间段的相对增殖率(见图4)。BGC823-OE组在24、48、72 h的相对增殖率明显低于NC组与Ctrl组，且具有显著的统计学意义(P<0.05)；MKN28-OE组在24、48、72 h的相对增殖率明显高于NC组与Ctrl组，同样具有统计学意义(P<0.05)，且两种细胞的NC组与Ctrl组的相对增殖率比较差异无统计学意义(P>0.05)。

*：与NC组比较，P<0.05；#：与Ctrl组比较，P<0.05。图3 KAI1蛋白在BGC823、MKN28细胞各组中的相对表达量

*：与NC组比较，P<0.05；#：与Ctrl组比较，P<0.05。图4 MTT法检测KAI1基因对胃癌细胞增殖的影响

2.5 KAI1过表达和沉默对胃癌细胞迁移能力的影响 BGC823-OE组的迁移细胞数目明显少于NC组与Ctrl组，MKN28-OE组的迁移数目明显多于NC组与Ctrl组，且具有显著的统计学差异(P<0.05)；两种细胞的NC组与Ctrl组迁移细胞数相比较无统计学意义(P>0.05,见图5)。

2.6 KAI1过表达和沉默对胃癌细胞周期的影响 流式细胞术检测结果提示BGC823-OE组S期占比明显少于NC组与Ctrl组，MKN28-OE组S期占比明显多于NC组与Ctrl组，且具有统计学意义(P<0.05)；两种细胞的NC组与Ctrl组S期占比相比较无统计学意义(P>0.05，见图6～7)。

A:BGC823-Ctrl组;B:BGC823-NC组;C:BGC823-OE组;D:MKN28-Ctrl组;E:MKN28-NC组;F:MKN28-OE组;*：与NC组比较，P<0.05；#：与Ctrl组比较，P<0.05。图5 BGC823、MKN28各组细胞迁移能力对比

A:BGC823-Ctrl组;B:BGC823-NC组;C:BGC823-OE组;D:MKN28-Ctrl组;E:MKN28-NC组;F:MKN28-OE组。图6 BGC823、MKN28各组细胞周期对比

*：与NC组比较，P<0.05；#：与Ctrl组比较，P<0.05。图7 BGC823、MKN28各组细胞S期占比对比

3 讨论

1995年Dong等[5]从鼠前列腺癌细胞AT6.1中分离出一种肿瘤转移抑制基因，即 KAI1，又称CD82,其能够在不影响原发性肿瘤形成的情况下抑制肿瘤转移。KAI1基因定位于人染色体11p11.2，大小约80 kb，包含了10个外显子和9个内含子。KAI1基因编码了一个267个氨基酸所组成的蛋白质，相对分子量29 600道尔顿，属于四次跨膜超家族(TM4SF)的成员。研究表明，许多发生转移的癌症当中，KAI1基因均呈现持续性低表达或不表达。有实验证实，KAI1可以通过作用于Src激酶介导的细胞内信号传导以促进肿瘤细胞之间的粘附，除此之外还可以通过调节癌细胞上的β-连环蛋白介导的信号传导来稳定或增强E-钙粘蛋白依赖性细胞间粘附，防止癌细胞从原发性肿瘤部位脱离，从而抑制肿瘤的转移[6-7]。此外，KAI1基因可以降低细胞膜上α6整合素的表达，导致其与层粘连蛋白的粘附性降低进而干扰细胞的运动能力与粘附能力[8]，还能够通过与整合素β1相互作用，干扰整合素介导的细胞内信号传导，抑制纤连蛋白诱导的上皮间质转化(EMT)并导致细胞运动与侵袭能力降低[9]。另有研究证明[10]，KAI1基因可以通过与趋化因子达菲抗原受体(DARC)的相互作用使肿瘤细胞与血管内皮细胞的粘附性增强从而抑制肿瘤细胞的转移，并通过调节TBX2和p21的表达来诱导肿瘤细胞的增殖抑制与衰老从而阻断肿瘤细胞的转移。这些结果表明KAI1基因可以通过不同的途径来抑制肿瘤细胞的转移。

本课题组前期筛选出了高表达KAI1的高分化胃腺癌细胞株MKN28和低表达KAI1的低分化胃腺癌细胞株BGC823，实验证实MKN28细胞的生长迁移能力明显弱于 BGC823细胞。由此推测，KAI1基因可能参与调控胃癌细胞的体外生长与迁移。为进一步明确KAI1基因对不同胃癌细胞体外生长迁移能力的影响，本课题用含有KAI1过表达载体的慢病毒感染人胃癌BGC823细胞，用含有KAI1 RNA干扰载体的慢病毒感染人胃癌MKN28细胞，感染后筛选扩增得到稳转的人胃癌BGC823、 MKN28细胞株，并通过蛋白免疫印迹法和荧光定量PCR对稳转细胞进行KAI1蛋白和mRNA表达的检测。结果显示人胃癌BGC823-OE组细胞的KAI1表达较NC组和Ctrl组上调，人胃癌MKN28-OE组细胞的KAI1较NC组和Ctrl组表达下降，且差异有统计学意义(P<0.05)，两种细胞NC组和Ctrl组KAI1表达差异无统计学意义(P>0.05)，说明稳转细胞株构建成功。

MTT法细胞增殖检测证明人胃癌BGC823-OE组细胞的相对增殖率明显低于NC组和Ctrl组，人胃癌MKN28-OE组细胞的相对增殖率明显高于NC组和Ctrl组(P<0.05)，同时Transwell实验显示人胃癌BGC823-OE组细胞较NC组和Ctrl组迁移能力明显下降，人胃癌MKN28-OE组细胞的迁移能力则明显强于NC组和Ctrl组(P<0.05)。流式细胞术检测人胃癌BGC823-OE组细胞S期占比也显著高于NC组和Ctrl组，人胃癌MKN28-OE组细胞S期占比较NC组和Ctrl组显著下降(P<0.05)。弭延斌等[11]研究发现，KAI1基因沉默后的人胰腺癌细胞，其体外生长、迁移能力明显强于空白组与阴性对照组；陈锋等[12]实验发现，过表达KAI1基因对人肾透明细胞癌细胞786-O增殖有显著抑制作用，与本实验结果相符。

本研究成功建立了稳定上调KAI1基因的人胃癌BGC823细胞株和稳定沉默KAI1基因的人胃癌MKN28细胞株，进一步的实验结果显示，上调KAI1 基因表达量能降低胃癌细胞株生长迁移能力，反之则增强胃癌细胞株生长迁移能力。这与本课题前期研究得出的不同胃癌细胞中KAI1基因的表达量与胃癌细胞生长迁移能力成反比的结果一致，由此我们推测，KAI1基因有负向调控胃癌细胞体外生长和迁移的能力，但其具体作用机制有待进一步深入探讨。本课题实验为后续行体内实验构建动物模型及研究KAI1基因具体分子作用机制提供实验基础和理论依据。