林小英，曾凡群，付 舒，任星桥，李叶丽，杨丹莉

(遵义医科大学 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室暨遵义医科大学 药学院，贵州 遵义 563099)

心肌肥大是高血压的常见并发症，是多种心血管疾病发生率与病死率升高的一个独立危险因素。病理性心肌肥大的持续存在会导致心律失常和心力衰竭，引发猝死[1]。过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)是一类由配体激活的核转录因子，是核激素受体超家族成员之一，有PPARα、PPARβ/δ和PPARγ三种亚型。PPARs参与脂质和能量的代谢以及炎症的调节，是心肌肥大的重要调节因子[2]。自发性高血压大鼠(Spontaneously hypertensive rats,SHR)的高血压并发症与人类相似，随着周龄的增加SHR会出现心肌肥大，并且在高血压病程中SHR的心肌肥大会持续存在[3-4]。

淫羊藿次苷Ⅱ(icarisideⅡ,ICS Ⅱ)作为一种多羟基黄酮类单体，是中国传统益补中药淫羊藿的主要活性成分之一。本课题组前期研究发现ICS Ⅱ具有降低血压、改善心肌纤维化以及抑制心肌细胞凋亡等多种心血管保护作用[5- 6]。故推测，ICS Ⅱ可能通过PPARs改善心肌肥大。因此，本研究以SHR为研究对象，旨在观察ICS Ⅱ对SHR心肌肥大的影响，并初步探讨其作用机制是否与PPARs的表达有关。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 淫羊藿次苷II(纯度≥98%，批号：FY17460602，南京泽朗医药科技有限公司)；BCA法蛋白定量试剂盒(货号：GK5012，上海捷瑞生物工程有限公司)；PageRuler Prestained Protein Ladder(货号：26617，Thermo Scientific公司)；PPARα兔抗大鼠抗体、PPARγ兔抗大鼠抗体、GAPDH兔抗大鼠抗体(货号：15540-1-AP、16643-1-AP、10494-1-AP，Proteintech公司)；HRP标记山羊抗兔IgG(货号：S0001，Affinity公司)；High-sig ECL Western Blotting Substrate(货号：180-501，Tanon公司)。

1.2 仪器 制冰机(日本三洋公司)；RM2245组织切片机(德国Leica Biosystems公司)；BX43显微镜(日本奥林巴斯公司)；5427R离心机(德国Eppendorf公司)；Mini-Protean3电泳仪、Mini Trans-Blot转移系统、ChemiDoc 成像系统(美国BIO-RAD公司)。

1.3 实验动物及分组 13周龄的雄性SHR 21只以及同龄雄性WKY 7只，均为无特定病原体(Specific pathogen-free,SPF)级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001。经SPF级动物实验室适应性喂养1周后，以WKY作为空白对照组(WKY组,n=7)，将SHR随机分为模型组(SHR组,n=7)、ICS Ⅱ 4 mg/kg剂量组(ICS II-L组,n=7)和ICS Ⅱ 16 mg/kg剂量组(ICS Ⅱ-H组,n=7)。ICS II-L和ICS II-H组大鼠每日灌胃ICS II混悬液一次至26周龄，同时SHR和WKY组大鼠灌胃等体积双蒸水。

1.4 实验方法

1.4.1 计算大鼠左心室质量指数 给药12周后，将大鼠禁食12 h称体重，腹腔注射2%戊巴比妥(2 mL/kg)，迅速用手术剪打开大鼠胸腔取出心脏，去除血管及其它多余组织后用预冷的生理盐水洗去心脏内外残留血液，滤纸吸干后分离大鼠左心室保留室间隔称重，计算大鼠左心室质量指数。大鼠左心室质量指数=大鼠左心室质量(mg)/大鼠体重(g)。

1.4.2 H&E染色 在近心尖5 mm处取约3 mm厚的大鼠左心室组织，4%甲醛溶液固定组织48 h，脱水，石蜡包埋，组织切片机切片后进行H&E染色，用正置显微镜观察大鼠左心室组织病理学变化。

1.4.3 蛋白免疫印迹法检测大鼠左心室组织PPARα和PPARγ的蛋白水平 分别称取大鼠左心室组织约100 mg，将组织剪碎后加入1 mL RIPA 裂解液与10 μL PMSF溶液，使用高速匀浆器在冰上进行组织匀浆，静置30 min，4℃、12 000 rpm离心15 min，取上清液。BCA法测定上清液的蛋白含量，使用8%分离胶和5%浓缩胶配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样30 μg蛋白电泳，用转移系统将凝胶上的蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5 %脱脂牛奶室温封闭3 h，TBST洗膜10 min×3次，4℃过夜孵育一抗：PPARα(1∶100 0)、PPARγ(1∶100 0)、GAPDH(1∶200 00)，TBST洗膜10 min×3次，室温孵育山羊抗兔IgG(1∶6 000)1 h，TBST洗膜10 min×3次，高敏ECL化学发光显色，ChemiDoc成像系统获取蛋白条带图像。

2 结果

2.1 大鼠左心室质量指数变化 与WKY组相比，SHR组大鼠左心室质量指数升高32.5%(P<0.05)；与SHR组相比，ICS Ⅱ-H组大鼠左心室质量指数降低15.2%(P<0.05)，见图1。

#：vs WKY，P<0.05； *：vs SHR，P<0.05；n =5。图1 ICS Ⅱ对大鼠左心室质量指数的影响

2.2 大鼠左心室组织病理学变化 H&E染色结果发现，WKY组心肌细胞排列致密有序；SHR组心肌纤维排列紊乱，部分心肌纤维断裂、溶解，细胞核形态不规则，细胞横径及细胞间隙增大，心肌细胞出现明显肥大；ICS Ⅱ-L组上述病理现象无明显改善；ICS Ⅱ-H组心肌纤维排列趋于整齐，断裂和溶解现象改善，细胞横径及细胞间隙减小，心肌细胞肥大明显改善,见图2。

标尺: 50 μm,放大倍数: ×400。图2 大鼠左心室H&E染色结果

2.3 ICS Ⅱ对大鼠左心室组织PPARα蛋白表达的影响 与WKY组相比，SHR组大鼠左心室PPARα蛋白表达下调29.1%(P<0.05)；与SHR组相比，ICS Ⅱ-H组大鼠左心室PPARα蛋白表达上调42.7%(P<0.05)，见图3。

2.4 ICS Ⅱ对大鼠左心室组织PPARγ蛋白表达的影响 与WKY组相比，SHR组大鼠左心室PPARγ蛋白表达下调24.7%(P<0.05)；与SHR组相比，ICS Ⅱ-H组大鼠左心室PPARγ蛋白表达上调30.3%(P<0.05)，见图4。

#： vs WKY，P<0.05；*： vs SHR，P<0.05；n=4。图3 ICS Ⅱ对大鼠左心室PPARα表达的影响

# ：vs WKY，P<0.05；* ：vs SHR，P<0.05;n=4。图4 ICS Ⅱ对大鼠左心室PPARγ表达的影响

3 讨论

心肌肥大是心脏对压力超负荷的适应性反应，表现为心肌质量的增加和细胞外基质的沉积，分为生理性心肌肥大和病理性心肌肥大[7]。生理性心肌肥大常见于运动员，可以增强心脏的功能而不损伤心脏。病理性心肌肥大常在高血压、心肌梗塞和主动脉狭窄等患者中出现。病理性心肌肥大在代偿期可以增强心脏的收缩和泵血功能，但持续的病理性心肌肥大会造成心肌功能减退，导致心力衰竭和心律失常，严重时会引发猝死[1]。

ICS Ⅱ作为中药淫羊藿的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗衰老以及抑制炎症反应等作用[8-9]。研究表明，ICS Ⅱ能够减轻SHR的高血压心脏病、改善糖尿病大鼠的心肌病、逆转主动脉狭窄小鼠的心室重构[10-12]。ICS Ⅱ具有良好的心血管保护作用，但ICS Ⅱ对SHR心肌肥大的作用及其具体机制尚需深入研究。本研究结果显示，ICS Ⅱ能够改善SHR左心室质量指数，改善SHR左心室心肌纤维排列紊乱、部分肌丝断裂与溶解以及心肌细胞横径与细胞间隙增大的病理变化，确证ICS Ⅱ具有改善SHR心肌肥大的作用。

PPARs有PPARα、PPARβ/δ和PPARγ三种亚型。在心肌组织中，激活PPARα能够使脂肪酸氧化关键酶基因表达上调，促进脂肪酸氧化，从而改善心肌细胞的脂质代谢和能量调节；PPARγ同样能够通过参与脂质代谢相关基因表达的调控，调节脂肪的储存和分解维持机体能量的平衡[2]。心肌组织是机体能量消耗最多的组织，脂质代谢和能量调节对心肌疾病的防治至关重要。研究发现，丹酚酸B能够上调PPARα的表达抑制糖尿病小鼠的心肌肥大[13]；姜黄素可以通过活化PPARγ/Akt/NO信号通路改善高糖高胰岛素诱导的心肌细胞肥大[14]；PPARγ激动剂罗格列酮可以改善糖尿病大鼠的心肌肥大[15]。因此，PPARα和PPARγ作为脂肪酸氧化酶的主要转录调控因子，可能通过参与心肌细胞的脂质代谢和能量调节，影响病理性心肌肥大的发生与发展[16]。本研究结果显示，与WKY组相比，SHR组大鼠左心室PPARα和PPARγ蛋白表达明显下调，提示在SHR模型中PPARα/γ信号通路被抑制。与SHR组相比，ICS Ⅱ-H组大鼠左心室组织PPARα和PPARγ蛋白表达明显上调，显示ICS Ⅱ能够抑制SHR左心室PPARα和PPARγ蛋白表达下调，提示ICS Ⅱ可能通过上调PPARα/γ信号通路改善SHR心肌肥大。