张永威，王敬伟，李新霞，李琳琳，邓凯，骆 新，王丽凤，毛新民，3

(新疆医科大学1.药学院；2.基础医学院；3.中医学院，乌鲁木齐 830011)

随着人们物质生活的丰富，血栓逐渐成为令人担忧的健康问题[1]。两色金鸡菊主要产于中国新疆[2]，具有抗凝血、降糖、降压及降脂等作用[3-7]，在中国西北部的一些地区可做为一种保健的茶水饮用。两色金鸡菊中主要成分为黄酮类化合物，其中马里苷和黄诺玛苷含量比较高。黄诺玛苷的常用分离方法有：大孔吸附树脂，ODS，聚酰胺，葡聚糖凝胶，制备液相等。本课题组前一阶段的实验研究结果表明两色金鸡菊乙醇提取物(ethanol extract，ETE)有抗凝作用[8]。同时也发现黄诺玛苷类的黄酮可以抑制动物血小板的聚集作用[9]。黄诺玛苷单体市面售价昂贵，因此，在本实验决定自制提取黄诺玛苷单体，在课题组前期的基础之上通过采用聚酰胺柱层析经过乙醇梯度洗脱得到黄诺玛苷。采用红外、质谱、核磁对得到的黄诺玛苷单体进行结构鉴定，及其抗血小板聚集实验。

1 仪器与试药

1.1仪器 血小板聚集仪(美国 Chrono-lo)；BC-2300分析仪(深圳迈瑞)；CAMAG REPROSTAR3薄层色谱(瑞士卡玛)；硅胶G高效板(青岛海洋化工)；IR-Prestige红外(岛津)；恒温水浴锅(BATHS，HH-S4)；ACQUITYR TQD质谱仪(Waters)；Inova 600型核磁共振(Varian)；LC-20AB型高效液相色谱仪(购自日本岛津仪器公司)。

1.2试药 两色金鸡菊干燥花序(新疆皮山县)；ETE物课题组自制(批号：20160526)；60～100目聚酰胺(青岛海洋化工厂，批号：3180216)；PEG和NP(Sigma，批号：D9754)二磷酸腺苷(Sigma，A2754)；凝血酶(Sigma，批号：T6884)；阿司匹林(Sigma，批号：A2093)。

2 方法与结果

2.1黄诺玛苷的制备 先将两色金鸡菊干燥花序(新疆皮山县)用55%乙醇回流提取得到ETE，再经乙酸乙酯萃取两次，得到乙酸乙酯的水部位AR经HPD-100大孔树脂吸附12 h后，再以体积分数为75%乙醇洗脱得到ETEP，将75%乙醇洗脱液浓缩后，湿法上样到100-200目的聚酰胺柱层析，吸附0.5 h后，将30%乙醇洗脱液经旋转蒸发，浓缩后，静置，析出淡黄色固体即为分离得到的黄酮类组分，经HPLC及MS鉴定为纯度为92%的活性物质黄诺玛苷。

2.2黄诺玛苷单体的鉴定

2.2.1HPLC分析 称取适量样品，溶于色谱甲醇，制成样品溶液，供测试用。HPLC分析条件：Shim-pack VP-ODS色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)。流速1.0 mL·min-1。检测波长280 nm。柱温35 ℃。进样量10 μL。流动相A：0.5%甲酸水；流动相B：乙腈。以5%的乙腈进行等度洗脱HPLC结果分析，Fr30%组分有一个响应值很高的色谱峰在21 min出现，和已知色谱图中的对照品黄诺玛苷出峰一致，其纯度的计算通过面积归一化法为92%。见图1，2。

图1 30%乙醇洗脱聚酰胺柱层析组分HPLC图谱

Fig.1HPLCchromatogramoftheconstituentselutedby30%ethanolwithpolyamidecolumnchromatography

①绿原酸；②黄诺玛苷；③马里苷；④奥卡宁。

①chlorogenic acid；②flavanomarein；③marein；④okanin.

Fig.2Chromatogramsofthecontrol

2.2.2红外光谱分析 红外光谱仪通过溴化钾压片法扫描样品得红外吸收光谱图。红外波谱中3344 cm-1的伸缩振动和-OH一致。1670 cm-1与C=O的伸缩振动相符。1618～1521 cm-1与苯环的伸缩振动相符。1460～1321与CH2的伸缩振动相符。1265与C-C的伸缩振动相符。1082与C-O的伸缩振动相符。样品的光谱特征与黄诺玛苷结构相符[10]。见图3，4。

2.2.3黄诺玛苷质谱分析 制成1 μg·mL-1样品溶液，测定一，二两级质谱图。测定条件：电离方式为电喷雾电离源(ESI)。多反应监测扫描(MRM)，毛细管电压3 kV，锥孔电压46 V，离子源温度120 ℃，去溶温度350 ℃，去溶剂化气流：500 L·Hr-1，锥孔气流：50 L·Hr-1。结果表明，当扫描范围在m/z 100～500区间时候。准分子离子峰[M-H]- m/z=449，提示分子量为450。与黄诺玛苷结构一致。二级质谱的主要离子为287，151，135。由UPLC-MS检测结果，有一个499的相对较高的峰出现，提取它的质谱图，出现m/z=449的碎片离子(图5)，和文献数中据比对为黄诺玛苷数据[10]报道一致。

图3 黄诺玛苷结构式

图4 黄诺玛苷红外光谱图

图5 黄诺玛苷质谱图

2.2.4核磁共振分析1H NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：9.01(1H，s，4'-OH)，9.05(1H，s，8-OH)，8.52(1H，s，3'-OH)，7.23(1H，dd，J=8.4 Hz，H-5)，6.86(1H，d，J=8.4 Hz，H-6)，6.91(1H，d，J=1.8Hz，H-2')，6.78(1H，d，J=7.8，1.8 Hz，H-6')，6.74(1H，d，J=7.8 Hz，H-5')，5.39(1H，dd，J=12.6，3.0 Hz，H-2)，2.68(1H，dd，J=16.8，3.6Hz，H-3α)，3.11(1H，dd，J=16.8，12.6 Hz，H-3β)，4.81(1H，d，J=7.8 Hz，H-1'')；13C NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：79.2(C-2)，43.4(C-3)，191.1(C-4)，118.0(C-5)，109.0(C-6)，150.7(C-7)，135.1(C-8)，150.5(C-9)，114.5(C-10)，129.9(C-2')，115.2(C-2')，145.1(C-3')，145.2(C-4')，116.5(C-5')，116.5(C-6')，101.5(C-1'')，73.2(C-2'')，77.3(C-3'')，69.5(C-4'')，75.7(C-5'')，60.6(C-6'') 以上核磁检测的波谱数据对黄诺玛苷中的化学位移均进行了合理的解释。与文献[10]中黄诺玛苷报道一致。

2.3乙醇提取物、黄诺玛苷对正常志愿者血小板聚集的影响

2.3.1样品血浆的收集 用3.8%枸橼酸钠采血管收集健康受试者的静脉血液。将采集后的志愿者静脉血浆置于离心机中先以1 300 r·min-1的转速离心，设置时间为10 min。用移液枪吸取上层血浆到EP管中储存得到富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)，再将采血管中剩余血样再以3 500 r·min-1的转速离心20 min，离心结束之后，移液枪吸取上清液移到EP管中得到贫血小板血浆(platelet-poor plasma，PPP)。通过PPP将PRP中的血小板数目保证控制在为2×1011个到3×1011个·L-1范围之间。

2.3.2乙醇提取物、黄诺玛苷对ADP诱导的健康受试者体外的血小板聚集影响 健康志愿者体外血小板的聚集率通过本教研室的血小板凝聚仪(490-4D)测得。取PRP分为空白对照组、ETE组(大900 μg·mL-1、中300 μg·mL-1、小100 μg·mL-1剂量组)、黄诺玛苷组(大90 μg·mL-1、中30 μg·mL-1、小10 μg·mL-1剂量组)、ASA组(500 μg·mL-1)。根据Born比浊法的实验方法。先在一号比色中里面加入PPP和30 μL供试液，再把确定好血小板数的PRP和另外30 μL供试液同时加入到二号比色杯中。设置孵育温度为37 ℃下时间为5 min。用PPP调零。检测血小板聚集率在加入5 μL凝血酶后5 min内记录的最大值。血小板抑制率=(对照组最大抑制率-药物组最大抑制率)/对照组最大抑制率×100%。实验数据的统计学分析通过SPSS17.0版软件运算。通过对照组可知，300 μg·mL-1、900 μg·mL-1的ETE对ADP诱导的血小板聚集有抑制作用(P<0.01)；90 μg·mL-1的黄诺玛苷对ADP诱导的血小板聚集有抑制作用(P<0.01)(表1)。

表1 醇提物及黄诺玛苷对ADP诱导的聚集率的影响

组别浓度/(μg·mL-1)聚集率聚集抑制率%空白对照组-53.83±3.817-乙醇提取物组10047.83±6.969①11.1430039.67±4.179②26.30900 38.17±3.710②27.23黄诺玛苷组1053.00±2.1911.543047.33±2.422①12.079039.33±4.274②26.93阿司匹林组500 38.67±7.866②28.16

①与空白对照组比较，P<0.05；②与空白对照组比较，P<0.01。

①Compared with control group，P<0.05；②compared with blank control group,P<0.01.

2.3.3AR、黄诺玛苷对凝血酶诱导的健康受试者的血小板聚集的影响 健康志愿者血小板的聚集率体外的实验通过本教研室的血小板凝聚仪(490-4D)测得。取PRP分为空白对照组、ETE组(大900 μg·mL-1、中300 μg·mL-1、小100 μg·mL-1剂量组)、黄诺玛苷组(大90 μg·mL-1、中30 μg·mL-1、小10 μg·mL-1剂量组)、ASA组(500 μg·mL-1)。根据Born比浊法的实验方法。先在一号比色中里面加入PPP和30 μL供试液，再把确定好血小板数的PRP和另外30 μL供试液同时加入到二号比色杯中。设置孵育温度为37 ℃下时间为5 min。用PPP调零。检测血小板聚集率在加入凝血酶5 μL后5 min内记录的最大值。血小板抑制率=(对照组最大抑制率-药物组最大抑制率)/对照组最大抑制率×100%。实验数据的统计学分析通过SPSS17.0版软件运算(表2)。

3 讨论

本实验通过采用聚酰胺柱层析的方法分离两色金鸡菊提取物里的黄诺玛苷，效果显著，得率能达到10%左右，并且洗脱剂选用的是乙醇和水，无毒性，便于后期保健药品和药品的开发，聚酰胺填料价格低可重复利用，这个实验工艺节约成本节约资源并且效果理想。凝血是血液变成凝胶状态的过程[11]。只要血管被划破出血时，人体就会产生生理性止血通过血小板聚集，凝血和血管收缩三个过程[12]。血栓和抗凝血因子异常有关，血液凝固增加，会使血小板和凝血因子增加可导致血栓形成[13-14]。凝血酶是高度特异性的水解酶[15]，由无活性的凝血酶原转化来[16]。本实验得到的黄诺玛苷的纯化方法稳定可操作性强，并且所采用的洗脱液体主要是乙醇无毒无害，本工艺可以运用到工业大规模提取黄诺玛苷，另外。黄诺玛苷结晶条件不太好控制，常温条件下析出晶体极慢，把聚酰胺洗脱液浓缩之后放在低温冰箱里放置一晚，可以较快析出黄诺玛苷结晶。黄诺玛苷性质稳定，不溶于甲醇，氯仿，当做黄诺玛苷的核磁鉴定时候，应当选择DMSO作为核磁共振氢谱和碳谱鉴定的溶剂。黄诺玛苷的抗凝血研究实验中，受试者的样本量不应少于10例，应该增大样本量获得更真实可靠的抗凝血实验结果。

表2 乙醇提取物及黄诺玛苷对凝血酶诱导的聚集率的影响

组别浓度/(μg·mL-1)聚集率聚集抑制率%空白对照组-59.00±4.690-乙醇提取物组10055.83±4.9565.3730053.83±2.858①8.7690036.67±2.805②37.84黄诺玛苷组1057.50±5.5412.543053.83±5.269①8.769048.83±3.601②17.23阿司匹林组50053.50±7.748①9.32

①与空白对照组比较，P<0.05；②与空白对照组比较，P<0.01。

①Compared with control group，P<0.05；②compared with blank control group,P<0.01.

综上所述，通过采用大孔吸附树脂和聚酰胺柱层析从两色金鸡菊中分离纯化得到黄诺玛苷单体。并通过一系列特定专业鉴定其为黄诺玛苷。由血小板聚集率实验数据可知，ETE和黄诺玛苷可抑制血小板聚集。并且黄诺玛苷可能是ETE抑制血小板聚集的有效成分。但作用机制仍不清楚。