李宝华，戈海泽，刘树业

天津市第三中心医院检验科，天津 300170

肝癌作为最常见的肝脏原发性肿瘤，是世界五大恶性肿瘤之一，位居肿瘤致死原因的第3位。肝癌常伴随肝炎、肝硬化[1]，所以人们认为病毒性肝炎、饮酒过度、遗传及非酒精性脂肪性病变是肝癌发生的重要原因[2-3]。原癌基因激活、抑癌基因失活及信号通路过度活化是肝癌发生的主要分子机制[4]。近年来，随着miRNA研究的不断深入，人们发现miRNA与肝癌的发生和发展有着十分重要的联系[5-6]，miRNA成为研究肝癌的热点之一[7]。miRNA是一段内源性单链小片段非编码RNA，有18～25个核苷酸，一般是通过靶向mRNA 3′UTR来调控细胞基因的表达[8]，从而广泛参与细胞的生命活动，如细胞增殖、凋亡、迁移、代谢等[9-10]。已有研究表明，许多miRNA(如miR-122、miR-199 和miR-21)[11-13]通过调控基因表达从而影响细胞的增殖、凋亡、迁移，参与肝癌的发生和发展过程[14-15]。本研究以肝癌细胞系Huh7细胞为模型，研究miR-499在肝癌发生和发展中的作用机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 人肝癌细胞株 Huh7 来源于中国科学院上海细胞库。于本院肝外科采集配对的肝癌组织标本和正常癌旁组织标本各20例，以及另外的35例肝癌组织标本。 本研究经本院伦理委员会审批通过，并与患者签订知情同意书。

1.2主要试剂 10 %胎牛血清、DMEM培养基和胰酶购自Gibico公司，1%青霉素-链霉素双抗购自Sigma公司。反转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)定量试剂盒、CCK8试剂盒均购自Thermo公司。RIPA全蛋白裂解液、脂质体2000、碘化丙啶购自Sigma公司。RAB5C一抗购自Abcam公司，结晶紫试剂购自Solarbio公司。

1.3方法

1.3.1细胞培养和转染 Huh7细胞在含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基中培养，培养箱条件37 ℃、5%CO2。当细胞融合度在90%左右时0.25%胰酶消化传代，每3天换液或传代1次。细胞转染按照脂质体2000转染方法，细胞传代后在细胞融合度为60%～70%时转染miR-NC或miR-499 mimics。

1.3.2RT-qPCR 细胞转染24～48 h后收集细胞磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍或将组织匀浆后加入Trizol提取总RNA，根据反转录试剂盒反转录获得cDNA，稀释cDNA后按照RT-qPCR定量试剂盒进行40个PCR。引物如下，miR-499-RT primer:5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTG CAC TGG ATA CGA CAA ACA T-3′;miR-499-qPCR-Fwd:5′-TGC GGT TAA GAC TTG CAG TG-3′；U6-RT:5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA AAA TAT GGA AC-3′；Oligo-dT:5′-TTT TTT TTT TTT TTT TTT-3′；U6-Fwd:5′-TGC GGG TGC TCG CTT CGG CAG C-3′；miRNA-universal reverse:5′-CCA GTG CAG GGT CCG AGG T-3′；RAB5C-qPCR-Fwd：5′-TCC TCC GCC TGA ATG ACC-3′；RAB5C-qPCR-Rev：5′-GGG AGG AAG TGG GAA GAG-3′。

1.3.3CCK8试验 按要求将Huh7细胞铺96孔板，5×103个细胞/孔，每组3个复孔。Huh7细胞转染miR-NC或miR-499 mimics 24 h后，分别于0、24、48、72 h向每孔加10 μL CCK8溶液，测量450 nm处吸光度值，根据公式计算细胞相对增殖活力。

1.3.4集落生成试验 Huh7细胞转染miR-NC或miR-499 mimics 24 h后，胰酶消化铺入24孔板，约500个细胞/孔。每72小时换一次培养基，2周后1×PBS洗2遍，普通结晶紫染色并记录集落形成个数，每个集落细胞数大于50，重复3次。

1.3.5流式细胞术 细胞转染miR-NC或miR-499 mimics 48 h后，胰酶消化，1×PBS洗2遍，加入70%乙醇溶液固定过夜。离心收集细胞，1 mL 1×PBS洗2遍，加入500 μL 1×PBS含50 μg/mL溴化乙锭，100 μg/mL RNase A 4 ℃避光，30 min。1×PBS洗1遍终止反应，流式上机检测。

1.3.6Western blot试验 Huh7细胞转染miR-NC或miR-499 mimics 48 h后，1×PBS洗2遍，按说明书加入适量RIPA全蛋白细胞裂解液4 ℃裂解30 min，12 000 r/min离心15 min，收集蛋白上清液。BCA蛋白定量后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔上样15 μg，转膜后5 %脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃孵一抗摇床过夜。第2天Tri吐温盐酸缓冲液洗3次，每次10 min，二抗室温孵育1 h，TBST洗3次，暗室曝光。

2 结 果

2.1肝癌组织和正常癌旁组织miR-499表达水平比较 通过TCGA及GEO公共数据库分析发现，miR-499表达水平在肝癌组织标本中是降低的，与正常癌旁组织比较，差异均有统计学意义(P<0.05)(图1A、图1B)；采用RT-qPCR检测发现，肝癌组织miR-499表达水平明显低于正常癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)(图1C)。

2.2miR-499与肝癌患者临床指标的关系 见表1。通过临床标本数据分析发现，高表达miR-499的肝癌患者中普遍存在肿瘤体积较小、TNM分期较低、淋巴结转移能力较弱且分化良好等临床表型。

注：A为TCGA数据库分析miR-499的表达水平;B为GEO数据库分析miR-499的表达水平;C为RT-qPCR检测miR-499的表达水平。

图1 肝癌组织和正常癌旁组织miR-499表达水平比较

表1 miR-499与肝癌患者临床指标的关系(n=35)

2.3miR-499抑制肝癌Huh7细胞的增殖能力 为进一步阐明miR-499在肝癌进程中如何发挥其生物学作用，本研究通过miR-499 mimics转染肝癌Huh7细胞，检测miR-499对肝癌细胞活性和集落形成能力的影响。CCK8试验结果显示，miR-499 mimics 转染Huh7细胞48 h后，细胞活性明显受到抑制，与miR-NC比较，差异有统计学意义(P<0.05)(图2A)；细胞集落形成试验表明，过表达miR-499明显抑制Huh7细胞的集落形成能力，与miR-NC比较，差异有统计学意义(P<0.05)(图2B、C)。

2.4miR-499抑制Huh7细胞的周期进程，促进Huh7细胞凋亡 流式细胞术细胞周期试验发现，过表达miR-499能明显抑制Huh7细胞G1期向S期转换，从而阻滞细胞周期的进程，与miR-NC比较，差异有统计学意义(P<0.05)(图3A、B)；流式细胞术细胞凋亡试验发现，过表达miR-499能明显促进Huh7细胞的凋亡能力，与miR-NC比较，差异有统计学意义(P<0.05)(图3C、D)。

2.5miR-499直接靶定RAB5C 通过TargetScan7.1、MicroRNA.org、MiRDB数据库预测miR-499的下游靶基因为RAB5C(图4A)；RT-qPCR显示，miR-499 mimics转染Huh7细胞后，RAB5C mRNA表达水平明显下降，与miR-NC比较，差异有统计学意义(P<0.05)(图4B)；Western blot试验显示，miR-499 mimics能够明显降低RAB5C蛋白表达水平，与miR-NC比较，差异有统计学意义(P<0.05)(图4C、D)。miR-499可直接靶定RAB5C并抑制RAB5C的表达水平。

注:A为CCK8试验检测miR-499对细胞活性的影响；B为集落形成试验检测miR-499对细胞相对集落形成能力的影响；C为集落形成试验。

图2 miR-499抑制肝癌Huh7细胞的增殖能力

注:A为流式细胞周期试验检测miR-499对细胞周期进程的影响；B为流式细胞周期试验；C为流式细胞术细胞凋亡试验检测miR-499对细胞凋亡的影响；D为流式细胞术细胞凋亡试验。

图3 miR-499对Huh7细胞周期及凋亡的影响

注:A为软件预测miR-499的靶基因；B为RT-qPCR检测miR-499对RAB5C mRNA的影响；C为Western blot试验检测miR-499对RAB5C 蛋白水平的影响；D为Western blot试验。

图4 miR-499直接靶定RAB5C

3 讨 论

肝癌是发病率和致死率都很高的一种恶性肿瘤，当前治疗手段有限，早期诊断困难是一直困扰人们的主要问题[16-17]。有文献报道，miRNA作为广泛存在的分子调控者参与了细胞的生长、增殖、迁移、分化、代谢等很多生物学表型[5]。随着研究者对miRNA更加深入的研究发现，很多肿瘤的发生和发展与miRNA的表达水平存在很密切的联系[18]。但是，不同的miRNA调控不同的基因表达变化，其调节网络的复杂性仍需要不断探究[19]。

有研究报道，miRNA在肝癌中差异表达是广泛存在的现象，在肝癌中表达下调的miRNA有许多已被证实具有抑制肝癌的作用，如miR-125b、miR-199、miR-101等[19-20]。本研究发现，在TCGA和GEO公共数据库及在肝癌患者的临床组织标本中miR-499表达水平明显减少，提示miR-499可能在肝癌发生和发展中起重要作用。通过临床病例分析及相关试验验证发现，miR-499能抑制细胞周期进程，加速细胞凋亡，并且能够抑制肝癌细胞的增殖能力。同时，本研究初步探究了miR-499抑制肝癌恶性表型可能的分子机制，并通过试验证明miR-499的下游靶基因之一是RAB5C，这也为进一步探究miR-499抑制肝癌细胞增殖的分子机制提供了新的思路。

本研究通过生物信息学数据库分析发现，miR-499的表达水平在肝癌患者中呈低表达，从而猜想miRNA可能与肝癌的发生和发展相关。进一步研究表明，miR-499能抑制Huh7细胞的增殖、集落形成及周期进程，并且可以促进Huh7细胞的凋亡。本研究探究miR-499在肝癌发生和发展中可能的下游靶基因RAB5C，并通过RT-qPCR和Western blot试验证明RAB5C确为miR-499的下游靶基因。本研究发现，miR-499通过下调RAS癌基因家族成员RAB5C，从而抑制肝癌的发生和发展。目前尚不清楚miR-499是如何通过RAB5C来调节相关信号通路，从而抑制Huh7细胞的增殖、集落形成及周期进程，并且促进Huh7细胞凋亡，但本研究也为miR-499在肝癌发生和发展中的作用机制开启了新思路。

本研究结果表明，miR-499可能通过下调RAB5C抑制肝癌细胞的周期进展及促进肝癌细胞凋亡来抑制肝癌细胞的增殖，从而抑制肝癌的发生和发展。本研究初步探究了miR-499、RAB5C与肝癌细胞的细胞周期进展、凋亡、增殖之间的关系，但具体分子机制仍然需要进一步探索。