万 涛，熊伟杰，王云涛

胃癌是临床常见恶性肿瘤，近年来随饮食结构的变化及生活方式的改变，胃癌发病率逐年上升[1]。目前尚未完全明确胃癌的发病机制，多认为与环境因素、基因突变、幽门螺杆菌感染等存在密切联系，上述因子均可通过影响机体功能基因及蛋白表达导致胃癌发病[2]。RLIP76为癌基因Ras家族关键成员，属Ral结合蛋白，为腺嘌呤核苷三磷酸(adenine nucleoside triphosphate,ATP)依赖非ABC转运蛋白，可简化细胞信号转导及物质转运，参与ATP水解，早期认为RLI76担负谷胱甘肽结合物转运，是肿瘤细胞产生耐药的关键机制[3]。近年来发现，RLIP76在肿瘤细胞生物学过程中有重要作用，可参与细胞分裂、增殖、分化及凋亡等过程，且在乳腺癌、肺癌中呈明显高表达[4-5]。但对其在胃癌中的作用尚未见报道。CD44则为肿瘤干细胞表面标志物，属特殊跨膜糖蛋白，参与淋巴细胞再循环过程，目前认为CD44蛋白与肿瘤细胞生物学行为存在密切联系，一般正常条件下，胃黏膜组织无CD44蛋白表达，而一旦检出CD44高表达则通常提示患者预后不佳[6]。基于此，本研究回顾性分析胃癌患者临床资料，为进一步探讨RLI76与CD44在胃癌血清及病理组织中的表达及意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2014年3月—2016年5月于成都市第五人民医院行手术治疗的82例胃癌患者的临床资料。纳入标准：病理确诊为胃腺癌；术前未接受放化疗、靶向治疗或生物治疗等抗肿瘤治疗；手术严格遵循无瘤原则；术中均留取癌旁组织及癌组织标本；术后均完成2年随访调查，且病例资料完整。排除标准：术后3个月内死亡者；存在严重围术期并发症者；其他器官恶性肿瘤转移至胃部者。其中男52例，女30例；年龄32～76(46.5±9.7)岁；合并淋巴结转移46例；临床分期：Ⅰ～Ⅱ期48例，Ⅲ～Ⅳ期34例；肿瘤分化程度：低分化32例，高、中分化50例。

1.2 主要试剂及仪器 鼠抗人CD44单克隆抗体、鼠抗人RLIP76单克隆抗体(均购自美国Abcam公司)，免疫组化试剂盒及通用型二抗试剂盒(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer solution,PBS)、牛血清白蛋白(blood serum albumin,BSA)、枸缘酸、二甲苯(均购自上海信然生物科技有限公司)，生物素化山羊抗小鼠免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)(购自武汉博士德生物工程有限公司)，链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(streptavidin-biotin-peroxidase complex,SABC)(购自上海源叶生物科技有限公司)，二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)(购自上海研拓生物科技有限公司)，CD44、RLIP76酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(均购自法国Diaclone公司)；37 ℃恒温烤箱(购自上海跃进医疗器械公司)，CX31型光学显微镜(购自日本Olympus公司)，RM-2135型组织切片机(购自德国Leica公司)。

1.3 方法

1.3.1 血清RLIP76及CD44表达测定 术前3 d、术后2周均留取患者空腹外周血标本2 mL，采用ELISA法测定血清RLIP76及CD44表达，均严格参照试剂使用说明进行操作，酶标板每孔包被抗原，37 ℃孵育30 min，甩干液体，吸净液体，每孔加入兔抗人RLIP76及CD44单克隆抗体100 μL，37 ℃孵育1 h，PBS洗涤3次×5 min，加入酶标二抗每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，洗板3次，加入底物，避光反应10 min，终止反应，DAB显色剂显色，中性树胶封片，酶标仪测定450 nm处吸光度值，根据标准曲线计算RLIP76及CD44表达情况。

1.3.2 病理组织RLIP76及CD44表达测定 术中取癌组织、癌旁组织(距原发灶边缘5 cm以上组织)标本，10%甲醛固定，石蜡包埋，常规组织切片，烤箱内固定，温度为60 ℃，60 min取出，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，去除标本内源性过氧化物酶，抗原修复，PBS冲洗3次，滴加5% BSA封闭，室温放置20 min，去除多余液体，滴入一抗，4 ℃过夜，PBS冲洗，滴入生物素化山羊抗小鼠IgG，5～10 min后PBS冲洗，滴加SABC，37 ℃反应20 min，PBS冲洗，DAB显色，反应20 min，苏木精复染，脱水后固定，PBS为阴性对照。RLIP76阳性表达定位于细胞浆，CD44蛋白阳性表达定位于细胞膜，呈棕褐色或棕黄色。每切片随机取5个高倍视野进行观察，以免疫积分半定量法[7]评定组织RLIP76、CD44表达水平。染色强度：无着色为0分；淡黄色为1分；棕黄色为2分；黄褐色为3分。染色比例：阳性细胞数<5%为0分；阳性细胞数5%～25%为1分；阳性细胞数26%～50%为2分；阳性细胞数51%～75%为3分；阳性细胞数≥76%为4分。最终评分=染色比例×染色强度，评分≥8分为阳性。并收集所有患者临床病理资料及预后情况，观察胃癌组织RLIP76、CD44表达与胃癌临床病理特点及预后的关系。

2 结果

2.1 胃癌患者手术前后血清RLIP76、CD44表达水平变化 胃癌患者血清RLIP76表达水平术前3 d(46.51±12.25)ng/mL比术后2周(24.15±9.77)ng/mL高，差异比较有统计学意义(t=18.390，P<0.05)；胃癌患者血清CD44表达水平术前3 d(445.26±54.74)ng/mL比术后2周(310.25±38.26)ng/mL高，差异比较有统计学意义(t=26.291，P<0.05)。

2.2 胃癌患者癌组织及癌旁组织RLIP76、CD44阳性表达情况比较 胃癌患者癌组织RLIP76阳性41例，阳性率为50.00%，CD44阳性48例，阳性率为58.54%，患者癌组织RLIP76、CD44阳性率均高于癌旁组织(χ2=48.681，65.063；均P<0.05)，图1，图2。

图1 胃癌组织与癌旁组织RLIP76表达(SP×200)

图2 胃癌组织与癌旁组织CD44表达(SP×200)

2.3 胃癌患者癌组织RLIP76、CD44表达与临床病理参数单因素分析 不同性别、年龄、肿瘤直径胃癌患者RLIP76阳性率、CD44阳性率差异比较无统计学意义(P>0.05)；组织分化程度为低分化、临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、伴淋巴结转移的胃癌患者RLIP76阳性率、CD44阳性率高于组织分化程度为高、中分化、临床分期Ⅰ～Ⅱ期及不伴淋巴结转移的胃癌患者，差异比较有统计学意义(P<0.05)。表1。

表1 胃癌患者癌组织RLIP76、CD44表达与临床病理参数单因素分析[n(%)]

2.4 胃癌预后多因素分析 82例患者均完成术后2年随访调查，RLIP76阳性、CD44阳性与RLIP76阴性、CD44阴性胃癌患者2年生存情况见图3、图4，RLIP76阳性、CD44阳性胃癌患者生存时间短于阴性者，但Log-Rank检验差异无统计学意义(χ2=2.057，P=0.151；χ2=0.452，P=0.501)；Cox分析显示淋巴结转移、临床分期、RLIP76阳性、CD44阳性均为影响胃癌预后的独立危险因素(P<0.05)，表2。

图3 RLIP76阳性、阴性患者生存分析

图4 CD44阳性、阴性患者生存分析

表2 胃癌预后影响因素多因素分析

3 讨论

胃癌是临床高发恶性肿瘤，死亡率高[8]，目前尚未完全明确其发生、进展、浸润及转移等恶性生物学行为的确切机制，对发生广泛淋巴结转移及远处转移的胃癌患者尚缺乏有效治疗手段。近年来，随着对肿瘤干细胞研究的不断深入，越来越多报道指出，肿瘤干细胞标志物具备自我更新及分化功能，且具备高致瘤性，可为肿瘤细胞群提供生长及增殖的条件，同时肿瘤干细胞具备运动及迁徙功能，可促进肿瘤细胞转移，在肿瘤生长、浸润及转移过程中有重要作用[9-10]。Xu等[11]指出，正常状态下，肿瘤干细胞维持稳定休眠状态，且有较强的耐药性，对治疗敏感性低，导致临床放化疗过程中无法完全杀灭肿瘤干细胞，是造成其复发、转移的原因。

CD44属特殊跨膜糖蛋白，为重要的细胞粘附分子，其蛋白可介导淋巴细胞归巢及向炎症、黏膜淋巴组织趋化，并粘附细胞外基质，又被称为巢受体，可与透明质酸、胶原蛋白结合，参与细胞与细胞外机制粘附[12]。研究发现，在较多恶性肿瘤中均可见CD44表达[13-14]。Hirata等[15]报道，胃癌患者血清CD44水平明显高于正常健康人。本研究对手术前后胃癌患者血清CD44水平进行测定发现，术前患者CD44水平处于较高水平，明显高于Wang等[16]检测的正常健康人血清CD44水平及患者术后2周CD44水平，提示胃癌患者血清CD44呈明显异常上调表现。同时对胃癌患者癌旁组织及癌组织CD44蛋白水平进行检测发现，癌组织CD44蛋白阳性率明显高于癌旁组织。行病理相关因素分析发现，随肿瘤临床分期的上升、肿瘤分化程度的降低，癌组织CD44蛋白阳性率上升，且伴淋巴结转移的胃癌患者癌组织CD44阳性率明显高于未发生淋巴结转移的患者，与早期研究结论相符，表明癌组织CD44水平的变化在一定程度上反映了胃癌浸润深度及侵袭、转移能力。此外，进行Cox预后分析发现，CD44阳性表达为影响胃癌患者术后生存的独立危险因素，表明肿瘤干细胞标志物CD44不仅参与肿瘤侵袭、转移过程，同样与患者预后存在密切关联，而通过检测胃癌组织CD44蛋白表达状况，则可科学预测胃癌复发、转移风险，指导临床治疗。

RLIP76则为ATP依赖非ABC转运型多功能转运蛋白，属Ral效应蛋白，连接Ral鸟嘌呤三核苷酸磷酸(GTP)酶与Rho通路，可将Ral激活后自细胞浆内募集至细胞膜，调节细胞生理功能[17]。RLIP76初次定位发现于红细胞，近年来发现，人类心脏、肾脏、白细胞、卵巢、肺部、肝脏等组织均可见RLIP76表达，且在肺癌、子宫内膜癌患者癌组织均可见RLIP76表达上调[18]。张正娥[19]研究发现，RLIP76物质转移功能是导致癌细胞化疗耐药的关键机制。也有动物实验发现，敲除RLIP76基因可影响肿瘤细胞增殖、凋亡、迁徙及转移过程[20]。RLIP76为Ras超家族成员，参与脂蛋白转运体调控细胞内过氧化脂质水平，同时可与Ral、Hsf-1结合影响细胞信号转导，调控细胞增殖、分化及凋亡，而下调RLIP76表达可抑制癌细胞侵袭，阻滞细胞周期。本研究检测手术前胃癌患者血清RLIP76水平发现，术前胃癌患者RLIP76水平异常上调，术后有明显降低，提示手术切除胃癌病灶可下调血清RLIP76水平。同时对癌组织及癌旁组织RLIP76蛋白表达水平进行测定发现，癌组织RLIP76阳性率明显高于癌旁组织。对RLIP76蛋白表达与胃癌临床病理特征关系进行分析发现，临床分期越高、分化程度越低且伴淋巴结转移的胃癌患者RLIP76蛋白阳性率较高。预后监测发现，RLIP76蛋白阳性为影响患者术后生存率的独立危险因素，提示RLIP76表达与胃癌发病、侵袭及淋巴结转移有关，推测其机制可能为RLIP76在细胞形态改变及细胞迁徙过程中有重要作用，持续RLIP76高表达可能通过影响细胞生长、迁移、分化、增殖及凋亡而导致胃癌发病及侵袭、转移。

综上所述，胃癌患者血清及癌组织RLIP76、CD44表达水平均较高，两者均与胃癌临床分期、肿瘤分化程度及肿瘤淋巴结转移有关，为影响胃癌术后生存的独立危险因素。