王一丁，汪 茜

乳腺癌发病率呈逐年上升趋势，随着治疗手段的不断进步，乳腺癌患者生存期逐渐延长。然而三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)在各组亚群中呈间质样表型，较激素受体(hormone receptor，HR)阳性乳腺癌具有更强的侵袭转移能力，而侵袭转移是影响晚期乳腺癌患者生存的主要因素[1]。因此，改变TNBC的间质表型成为延长TNBC患者生存期的重要途径。越来越多的学者认为上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在乳腺癌的发展过程中发挥重要的作用[2-4]，而找到EMT的调控机制并且逆转这一过程，成为近年来乳腺癌的研究热点。我们的前期研究发现，雌激素受体(estrogen receptor,ER)拮抗剂4-羟基他莫昔芬(4-Hydroxytamoxifen，4-OHT)在TNBC中具有逆转EMT的作用，能够提高TNBC的药物敏感性。

随着EMT机制的深入研究及上游调控通路的深入挖掘，微小RNA(microRNAs，miRNA)逐渐成为上游调控EMT的研究热点[5-6]。早期研究发现，miRNA-200家族(miR-200s)能够在EMT的过程中受到明显抑制，提示miR-200s是抑制EMT的主要调节因子；miR-200c是miR-200s中的重要成员，在ER状态不同的乳腺癌细胞表达中具有显著差异[7]。很多研究报道恢复miR-200c的表达能够维持细胞的上皮表型，抑制间质表型调控EMT[8]。

MiRNA的序列是呈高度保守性的，然而表观遗传学的因素能够在不改变基因序列的前提下对其进行表观修饰，影响miRNA靶基因的转录及表达[9]。甲基化是表观遗传学的重要研究内容，能够调控基因的表达、对蛋白质及核酸进行修饰[10]。甲基化的过程需要甲基化转移酶催化完成。一项在结直肠癌细胞中进行的研究发现，干扰甲基化转移酶表达，能够使10%的miRNA表达受到影响，证实DNA甲基化是调控miRNA的重要机制之一[11]。而对于miR-200c启动子特异位点的甲基化，也逐渐成为研究热点。有研究认为，在诱导细胞发生EMT的过程中，miR-200c启动子发生甲基化，部分功能受到抑制，导致原癌基因C-myb及zeb1的表达升高[12]。本研究旨在探讨4-OHT通过抑制DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)1和DNMT3A表达逆转TNBC细胞的EMT作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂 RPMI1640培养基购于美国Gibco公司；4-OHT购于美国Sigma公司；胎牛血清购于天津血液病研究所；ER-α，PR，人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)，Vimentin抗体购于美国Cell Signalling Technology公司；DNMT1、DNMT3A、Actin等其他抗体购于美国Santa Cruz公司；羊抗鼠和羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司；ECL试剂盒购于PIERCE公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 选择乳腺癌细胞株MDA-MB-231、具有上皮样表型的HR阳性乳腺癌细胞MCF-7和经阿霉素长期培养的阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADR，检测ER、PR及HER-2表达，明确3种细胞系分型。乳腺癌细胞株MDA-MB-231生长于含有10%灭活胎牛血清、12 U/mL庆大霉素的L15培养液中；MCF-7细胞生长于含有10%灭活胎牛血清、12 U/mL庆大霉素的RPMI1640培养液中；MCF-7/ADR细胞生长于含有10%灭活胎牛血清、12 U/mL庆大霉素、1 μmol/L阿霉素的RPMI1640培养液中，维持阿霉素耐药性，均于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内培养，0.25%胰酶消化液消化传代，2～3 d传代1次。所有实验均采用对数生长期细胞。

1.2.2 Western Blot 检测蛋白水平 分别收集3种细胞系细胞1×107个，将其裂解于200 μL含有蛋白酶抑制剂(100 μg/mL PMSF，2 μg/mL Aprotitin)的RIPA裂解液中[0.1%SDS，1% Trito-100，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA(pH=8.0)，10 mmol/L Tris-HCl(pH=7.5)]，4 ℃裂解40 min，13 000 r/min离心取上清，蛋白定量。与3×样品缓冲液混合后，煮沸5 min。将样品(30 μg/道)在10%的SDS-聚丙烯凝胶中进行电泳3 h，然后转印至硝酸纤维素膜上(电压：2 mV/cm2；时间：120 min)。用5%脱脂牛奶封闭1 h后，按预染Marker标记的分子量剪裁转印膜，分别加入兔抗人ER-α抗体(1∶1 000)、PR抗体(1∶1 000)、HER-2抗体(1∶1 000)、Vimentin抗体(1∶1 000)、DNMT1抗体(1∶1 000)、DNMT3A抗体(1∶1 000)和β-actin抗体(1∶1 000) 4 ℃过夜。TTBS洗4次后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠(1∶800)或羊抗兔二抗(1∶800)室温作用30 min，ECL法显色，GIS凝胶图像分析系统照相并分析处理。

1.2.3 实时定量PCR检测miR-200c相对表达量 细胞总RNA的提取:收集各实验组细胞，按TRIzol试剂盒说明提取RNA,Nanodrop鉴定RNA质量并在260/280 nm测其浓度。RNA逆转录过程采用One Step PrimeScript®miRNA cDNA Synthesis Kit(Takara,Japan)法；miRNA的相对表达量采用comparative cycle threshold(Ct)法；U6 small nuclear RNA为内参；miR-200c特异性引物序列：5′-ACACTCCAGCTGGGTAATACTGCCGGGTAA-3′；U6引物序列：正向5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′；反向5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；试剂盒中包含Uni-miR qPCR引物；采用SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ (Perfect Real Time) (Takara,Japan)检测miRNA相对表达量；PCR条件为：95 ℃，25 s，95 ℃，5 s，58 ℃，34 s，共45个循环；采用threshold cycle和2-ΔΔCt法计算miRNA相对表达量，实验重复3次。

1.2.4 4-OHT作用于乳腺癌细胞 前期研究及大量文献证实miR-200c在EMT中的重要调控作用。将3种乳腺癌细胞MCF-7、MCF-7/ADR和MDA-MB-231铺板过夜，应用5 μmol/L的4-OHT作用(实验组)MDA-MB-231、MCF-7/ADR和MCF-7细胞2 d后，应用实时定量PCR技术检测miR-200c的表达，将未应用4-OHT作用(对照组)MDA-MB-231、MCF-7/ADR和MCF-7细胞的miR-200c表达量作为100%，分析实验组在药物作用后miR-200c表达的相对变化。

1.2.5 CpG岛预测 通过MethPrimer在线引物设计工具页面:http://www.urogene.org/methprimer[13]，输入miRNA启动子的序列，得到CpG岛预测结果。

1.2.6 4-OHT作用于MCF-7/ADR细胞影响DNMTs表达 4-OHT作用于MCF-7/ADR细胞3 d，检测DNMT1和DNMT3A蛋白表达情况；应用瞬时转染干扰RNA表达，单独及联合敲除DNMT1、DNMT3A后应用实时定量PCR技术检测miR-200c表达变化；应用4-OHT作用于联合敲除DNMT1、DNMT3A的MCF-7/ADR细胞后，Western Blot方法检测EMT相关间质表型标记物Vimentin的变化。

2 结果

2.1 3种乳腺癌细胞中激素状态/HER-2表型及miR-200c表达情况 如图1A所示，MCF-7为HR受体阳性，HER-2阴性乳腺癌细胞；而经过阿霉素长期培养的MCF-7/ADR细胞株的HR受体转为阴性，ER-α、PR及HER-2表达呈三阴性；MDA-MB-231乳腺癌细胞激素受体状态同MCF-7/ADR。应用实时定量PCR检测3种细胞中miR-200c的表达，具有间质样表型的TNBC细胞MCF-7/ADR、MDA-MB-231细胞中miR-200c表达显著低于HR受体阳性的MCF-7细胞(图1B)。

2.2 4-OHT作用于乳腺癌细胞其miR-200c相对表达变化 MDA-MB-231和MCF-7/ADR细胞在4-OHT作用后miR-200c表达分别升高(21.6±8.56)倍和(6.98±2.15)倍，差异比较具有统计学意义(P<0.05)；MCF-7细胞在4-OHT作用前后miR-200c表达差异比较无统计学意义(P>0.05)。图2。

图1 3种乳腺癌细胞中激素状态/HER-2表型及miR-200c表达情况

图2 4-OHT作用于乳腺癌细胞其miR-200c相对表达变化

2.3 CpG岛预测软件分析miR-200c基因启动子区的甲基化状态 利用CpG Island预测软件分析miR-200c基因启动子区的甲基化状态，蓝色区域表示CpG岛富集区。经软件预测在miR-200c基因序列之前富含有CpG岛。图3。

图3 miR-200c启动子区CpG岛分布图

2.4 应用4-OHT作用于MCF-7/ADR细胞DNMT1和DNMT3A表达情况 应用4-OHT作用于MCF-7/ADR细胞3 d，检测DNMT1和DNMT3A蛋白表达情况，发现在4-OHT作用下DNMT1和DNMT3A表达均有下调(图4A)；进一步在MCF-7/ADR细胞中敲除DNMT1或DNMT3A的表达并进行实时定量PCR检测发现miR-200c表达差异比较无统计学意义(P>0.05)，而同时敲除DNMT1和DNMT3A的表达，miR-200c表达上调(1.87±0.12)倍，差异比较具有统计学意义(P<0.05)(图4B，4C)。敲除DNMT1和DNMT3A的表达后检测EMT指标的变化，发现同时敲除DNMT1和DNMT3A后Vimentin表达下调，类似于4-OHT的作用，而在此基础上应用4-OHT能够更显著的逆转EMT(图4D)。

图4 4-OHT作用于MCF-7/ADR细胞影响DNMTs表达

3 讨论

TNBC具有更强的侵袭转移能力，很快发生复发、转移及耐药，目前的治疗仍缺乏有效的靶向及内分泌药物，患者面临高复发风险及短暂的生存期。研究显示，部分TNBC呈现间质表型。有研究证实miR-200c在乳腺癌、非小细胞肺癌和膀胱癌等多种实体肿瘤中与EMT存在紧密联系[14-16]。我们前期研究经过miRNA芯片筛查发现在TNBC和非TNBC 2种细胞系中miR-200c表达差异显著[17]，说明miR-200c与三阴状态也存在密切联系[18]。Park等[19]研究结果表明在子宫内膜癌细胞中，4-OHT能够通过miR-200c上调c-myc促进子宫内膜癌上皮细胞发生EMT，从而导致细胞侵袭能力增强，这证实了4-OHT与miR-200c之间存在的联系。本研究中miR-200c在TNBC细胞中表达显著低于非TNBC细胞，而在TNBC细胞中应用4-OHT后miR-200c表达升高，可能是4-OHT部分解除了miR-200c受到的抑制作用。

DNMT是DNA甲基化发生的必要催化酶，DNMT的活性及表达程度能够影响基因的甲基化状态[20]。近年来越来越多研究报道，在多种肿瘤中DNMTs的上调与不良预后相关[21]。降低DNMTs的活性能够影响甲基化的状态[22]。一项在结肠癌中的研究报道[23]，应用RNAi单独干扰任意一种DNMT都不能影响miRNA的表达，但同时敲除2种蛋白能够调控10%miRNA的表达，深入探究发现这些有变化的miRNAs，其启动子区域均有CpG岛存在。本研究对miR-200c的启动子进行了CpG岛的预测，证实miR-200c的启动子区存在甲基化的位点。接着，应用4-OHT作用于间质样TNBC细胞，检测DNMTs的表达，发现DNMT1、DNMT3A表达降低。进一步在DNMTs高表达的MCF-7/ADR细胞中敲除DNMTs，发现同时敲除DNMT1和DNMT3A能够上调miR-200c的表达，且能够降低间质表型Vimentin的表达。

综上所述，本研究通过深入研究4-OHT对于间质样TNBC细胞的作用机制，证实了4-OHT对DNMTs表达的调控，通过调控DNMTs表达发挥全面去甲基化作用调控miR-200c的表达，从而逆转间质样表型的表达，为进一步寻找4-OHT非雌激素受体依赖机制提供科学依据，具有一定临床意义。对miR-200c启动子上的甲基化位点进行特异性检测有待进一步深入的研究。