刘珍君，王 波，肖梦媛，曾维凯，余 丽，余丽琴，彭子健，魏文燕，陈建英

高血压病是最常见的慢性病之一[1]，2016年我国约有2.7亿高血压患者，部分患者并无症状，但可以发生心脑肾等器官损害，导致脑卒中、心肌梗死事件甚至死亡，且脑卒中有高发病率、高致残率的特点，约70%～80%患者因残疾丧失独立生活能力[2-3]。幸运的是，高血压是可以治疗的，降低患者血压水平，可明显减少脑卒中及心脏病事件，显著改善患者的生存质量，有效减轻疾病负担[4]。因此，针对高血压尤其是脑卒中的防治显得尤为重要。

自发性高血压大鼠(spontaneous hypertensive rats,SHR)是1963年日本Okamoto用Wistar京都种大鼠(WKY)通过选择性交配而培育出的品种，是目前国际公认的最接近于人原发性高血压的动物模型，是基础研究及药物筛选的首选[5-6]。前期研究发现间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)及其外泌体(MSCs-exosomes，MSCs-exo)可通过减轻肺血管重构从而达到减低肺动脉压力[7]。本研究通过骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)及其外泌体(BMSCs-exosomes,BMSCs-exo)干预SHR动物模型，观察SHR血压、脑血流灌注量和脑卒中发生情况，探讨BMSCs及BMSCs-exo是否能减低SHR血压，降低脑卒中的发生率。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器设备 α-MEM培养基(美国Gibco公司)、DMEM培养基(美国Gibco公司)、胎牛血清(美国Gibco公司)、BCA蛋白定量试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)、台式超速冷冻离心机(日本HITACHI公司)、高速台式离心机(湖南赛特相仪离心机仪器有限公司)、FACS Calibur流式细胞仪(美国Becton-Dickinson公司)、ALC.V8型动物呼吸机激光多普勒血流灌注成像系统压力换能器(YP900型)(北京新航兴业科贸有限公司)、WinMDl2.9流式数据分析软件(美国WinRAR公司)、Medlab生理记录仪(南京美易)、透射电镜(型号JEM-1400,日本Olympus公司)、纹式血管钳、持针器、眼科剪、手术镊、眼科镊、组织剪、线剪、小型动物开胸器、小型拉钩。

1.2 BMSCs及BMSCs-exo提取、培养与鉴定 取4～5周龄SPF级SD大鼠，取出双侧股骨、胫骨及肱骨，采用胰酶消化法进行传代及全骨髓直接贴壁分离法进行BMSCs鉴定；取常规培养、生长良好的第3代大鼠BMSCs，收集BMSCs-exo，BCA法蛋白定量，电镜下形态鉴定，流式细胞术表型鉴定，技术方法详见参考文献[7]。

1.3 实验动物选取及分组 选用雄性12周龄的SHR 36只，按照随机原则分为3组：BMSCs-exo组、BMSCs组和NaCl组，每组各SHR 12只，进行不同的干预。BMSCs-exo组大鼠通过尾静脉注射30 μg/μL的BMSCs-exo进行干预处理(BCA蛋白定量方法测定其浓度)，隔日1次，共注射7次；BMSCs组通过尾静脉注射BMSCs(1×106)干预处理，共1次；NaCl组(阳性对照组)大鼠尾静脉注射生理盐水20 μL/kg进行干预，共1次。选用雄性12周龄的SD大鼠12只，为Nor组(阴性对照组)，尾静脉注射生理盐水20 μL/kg进行干预，共1次。

1.4 各组大鼠生活习性观察及脑血流灌注量检测 ①体重测量：各组大鼠每隔1周1次用天平进行称量并记录。②外周血压测量：各组大鼠每周测量2次外周尾动脉血压，将大鼠固定于血压测量固定装置中，尾部外露，测定大鼠尾部动脉收缩压5次，以每次血压相差不超过5 mmHg为准，血压取3次测定平均值，记录各组大鼠的外周动脉压力曲线。③生活习性和脑卒中临床评分：每天喂食水时观察各组大鼠的生活习性有无改变，采用脑卒中临床表现评分：1分为活动少，运动量轻度减少或轻度兴奋；2分为活动很少，运动量明显减少或激惹亢奋；3分为俯卧不动，不能行走，忧郁性症状；4分为瘫痪，不能站立，任何1侧或双侧肢体麻痹。④脑血流灌注量指标检测：在各组大鼠干预的第4～6周，采用多普勒血流测量仪对各组大鼠急性脑血流灌注量进行检测，记录图像及数值。并通过左心室穿刺法，由Medlab生理测量仪测定各组大鼠左心室压力，收集图像并记录数值。

2 结果

2.1 BMSCs的形态学观察 原代培养的BMSCs第3天形态不均一，呈类圆形或椭圆形(图1A)；细胞培养至第3代时，为均一的纺锤形成纤维细胞样，排列稍紧密，呈辐辏样、漩涡状集落排列生长(图1B)。对第3代BMSCs进行成骨、成脂诱导分化鉴定，BMSCs经成骨诱导及茜素红染色后，在细胞外基质可见橘红色钙结节沉积形成(图1C)，BMSCs经成脂诱导及油红O染色后，在细胞胞浆内可见有红色脂肪液滴形成(图1D)。

2.2 BMSCs-exo的鉴定 透射电镜观察：随机视野下看到提取物直径分布范围集中在30～150 nm，呈囊体结构，形态近似球形或椭球形，大小均一(图2)。纳米示踪分析：取适量提取物稀释至1mL加入样品池，在显示器上观察，样品池内粒子成布朗运动，波峰分布在150 nm左右(图3)。

图3 纳米示踪分析下BMSCs-exo直径波峰图

2.3 流式细胞仪检测BMSCs-exo的表面抗原 经WinMDI 2.9软件对结果进行分析，外泌体BMSCs-exo特异性分子CD63、CD81均为阳性表达(图4)。

图4 BMSCs-exo流式细胞仪鉴定结果图

2.4 各组大鼠尾动脉收缩压测定结果 干预的第6周对各组大鼠进行尾动脉收缩压测定，可通过Medlab生理记录仪器获得大鼠尾动脉收缩压值(图5)。大鼠尾动脉收缩压较正常组(Nor组)显著升高(P<0.001)，BMSCS组和BMSCs-exo组尾动脉收缩压较NaCl组降低，仍高于Nor组，差异比较具有统计学意义(P<0.05)，但BMSCs-exo组与BMSCs组之间尾动脉收缩压差异比较无统计学意义(P>0.05)(图6)。

图5 各组大鼠尾动脉收缩压图像

注：与NaCl组比较，*P<0.05；与Nor组比较，#P<0.001，△P<0.05，▲P<0.01图6 各组大鼠尾动脉收缩压比较

2.5 各组SHR生存率及脑卒中临床评分 各组大鼠生存率结果：在SHR进行不同组别的干预后第6周，NaCl组大鼠死亡3只，生存率75%(9/12)，BMSCs-exo组死亡3只，生存率75%(9/12)， BMSCs组死亡2只，生存率83.3%(10/12)，SD大鼠没有死亡，生存率为100%(12/12)。

生活习性及卒中评分结果：1分比率：NaCl组25.0%，BMSCs组50.0%，BMSCs-exo组33.3%；2分比率：NaCl组25.0%，BMSCs组16.7%，BMSCs-exo组25.0%；3分比率：NaCl组33.3%，BMSCs组25.0%，BMSCs-exo组25%；4分比率：NaCl组16.7%，BMSCs组8.3%，BMSCs-exo组16.7%。与NaCl组大鼠比较，BMSCs和BMSCs-exo组大鼠1分占比较高，尤其是BMSCs组；4分的占比BMSCs组较低。

2.6 各组大鼠脑血流灌注量测定结果 对各组大鼠进行腹腔麻醉并去除大鼠头颅皮肤以及脂肪组织后，采用激光多普勒血流测定仪器对大鼠脑血流灌注量进行检测(图7)，并利用Image-Pro-Plus图像分析软件进行脑血流灌注量数值统计分析。在对SHR模型干预的第6周，NaCl组大鼠脑血流灌注较Nor组大鼠显著下降(P<0.001)，BMSCs组和BMSCs-exo组较NaCl组脑血流灌注量升高(P<0.05)，但2组间差异比较无统计学意义(P>0.05)(图8)。

图7 各组大鼠脑血流灌注测量图像

注：与NaCl组比较，*P<0.05；与Nor组比较，#P<0.001，△P<0.05图8 各组大鼠脑血流灌注量比较

2.7 各组大鼠左心室平均压力测定结果 通过开胸行左心室穿刺法对各组大鼠进行左心室压力测定，通过Medlab生理记录仪器以及大鼠心功能测量仪获得大鼠左心室压力平均值(图9)。在干预第6周，NaCl组大鼠左心室平均压力显著高于Nor组(P<0.001)，BMSCs组和BMSCs-exo组左心室压力均较NaCl组左心室压力降低(P<0.05)，仍高于Nor组(P<0.05)，但BMSCs组与BMSCs-exo组之间差异比较无统计学意义(P>0.05)(图10)。

图9 各组大鼠左心室压力图像

注：与NaCl组比较，*P<0.05；与Nor组比较，#P<0.001，△P<0.05图10 各组大鼠左心室压力比较

3 讨论

BMSCs是一类具有多向分化潜能的成体多能干细胞，已有研究证实BMSCs移植在心肌梗死、肺动脉高压、肾损伤及脑缺血等发挥一定的作用，并能不同程度修复受损器官功能[8]。据报道BMSCs能分泌促进血管神经生成的生存因子[9]，脑缺血动物模型显示干细胞分泌可减少脑损伤和促进神经恢复[10]。研究发现miRNA的细胞间通讯通过外泌体，小的脂质微泡，显示可促进脑的修复[11]。BMSCs-exo表面表达大量的生物活性物质、膜锚定受体、粘附分子、细胞表面特异抗原等，参与调控重要的细胞生理活动，在细胞凋亡、血管生成、炎症反应过程中的作用均有报道，改善脑卒中的神经损伤和神经保护作用，与增强血管神经的生成有关[12]。BMSCs在干细胞治疗应用中存在细胞多向分化以及致瘤性等特点，而BMSCs-exo无以上风险，更具备临床转化优势。研究表明[13]，BMSCs-exo可通过功能性血管紧张素Ⅱ1型受体调节血压[14]，也可通过自身含有并表达的miRNA调节血压[15]。

BMSCs及BMSCs-exo可显著改善缺血性脑卒中的神经功能缺损、运动功能及日常生活能力，不良反应少[7]，但极少用于脑卒中的预防研究。本研究通过对SHR尾静脉注射BMSCs和BMSCs-exo进行早期干预，得出的实验结果为大鼠的脑卒中临床评分为1分占比BMSCs-exo组和BMSCs组明显高于NaCl组，4分组BMSCs较NaCl组降低，而且各组大鼠生存率比较以BMSCs组最低，提示BMSCs和BMSCs-exo进行早期干预SHR能一定程度改善大鼠的活动能力。进一步观察各组大鼠尾动脉收缩压发现，NaCl组血压最高，BMSCs-exo组和BMSCs组干预后平均动脉压有一定程度的下降，尚未降低正常大鼠水平。而且NaCl组大鼠相比较，监测BMSCs-exo组与BMSCs组2组大鼠有创的左心室压力均有一定程度的下降，且脑血流灌注量升高，提示BMSCs及BMSCs-exo干预均降低SHR外周血管压力及左心室压力等，可改善SHR脑血流灌注量，进一步提示大鼠的生活能力的改善可能与大鼠外周血压的降低有关，可降低SHR脑卒中的发生风险和致残率。

在本研究中证实，BMSCs及BMSCs-exo干预SHR后，不仅可明显降低动脉压力，可改善脑灌注量，减低脑卒中的风险和发生机率，并且可降低左心室压力，减轻心脏负荷，降低心功能不全的风险，对高血压所致的心脑血管损害具有显著的预防作用。其机制可能是通过抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统，并调控相关细胞因子生成等，尚有待进一步的研究去证实和完善。