王延辉，周文斯，何艳丽，沈诗珺

(1.浙江医药高等专科学校 食品学院，浙江 宁波 315000；2.华南理工大学 食品科学与工程学院，广州 510640)

酱油是一种世界流行的色、香、味俱全的液体调味品，尤其是在中国、日本、韩国等东亚国家。它主要是以大豆(豆粕)或小麦等为主要原料，添加米曲霉固态制曲和液态酱醪发酵制备而成。在大曲发酵过程中，各种微生物(如米曲酶等)的生理代谢和丰富酶系的生化作用将原料中的蛋白质、淀粉等大分子物质消化分解成小分子肽、游离氨基酸、糖类等小分子物质，赋予了酿造酱油浓郁持久的香气和丰富饱满的醇厚滋味[1,2]。酱醪发酵过程中，大豆或小麦蛋白可被蛋白酶水解成小肽或游离氨基酸，释放出来的谷氨酰胺可以进一步水解脱氨生成谷氨酸，因此获取优质鲜味发酵酱油的关键之一是提高大曲的蛋白酶和谷氨酰胺酶活力[3]。酱醪发酵温度是影响优质酱油生产的重要因素之一。Wu等[4]发现发酵温度对酱油的老化和品质有显著影响，将酱醪发酵温度提高到45 ℃会加速老化并降低酱油中乙醇的含量。Hoang等[5]的优化实验表明酱醪在温度40.7 ℃、盐水用量10%(W/W)的条件下发酵4.6 d，此时酱油中氨基酸态氮的含量较高。Su等[6]研究了温度和氯化钠浓度对酱油蛋白水解酶和淀粉酶活性的影响，发现45 ℃发酵可作为一种快速发酵方法，可以缩短酱油的生产时间，而5%氯化钠与45 ℃发酵组合是制备酱油的最佳预水解条件。然而目前很少有报道研究低温胁迫发酵工艺对酱油酿造过程中滋味物质形成的影响。

本文旨在全面监测发酵酱油在初期低温胁迫发酵工艺下的各种理化指标动态变化，通过分析酱醪酿造过程中的pH值、谷氨酰胺酶活、中性蛋白酶活变化，结合总氮、氨基酸态氮、总糖、总酸含量以及滋味感官分析，系统研究不同酱醪发酵工艺的酱油在酿造过程中滋味物质的释放规律，探究低温胁迫发酵工艺改善酱油品质的内在机理，从而为调味品行业以及提高酱油品质等方面提供理论依据和方法指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

米曲霉曲精(Aspergillusoryzae)：山东市济宁玉园生物科技有限公司；低温食用豆粕：山东市禹王实业(集团)有限公司；原料面粉、食盐等：均为市购。

1.2 试验试剂

浓硫酸、柠檬酸(一水)、三氯乙酸、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、氯化钾、甲醛及苯酚：均为分析纯；谷氨酰胺、酪蛋白及福林酚试剂：均为生化试剂；碘化丙啶、氨基酸标准品：均为色谱纯，购于美国Sigma公司。

1.3 试验主要仪器设备

HYP-308消化炉、KDN-103F自动定氮仪 上海纤检仪器有限公司；Bante 321-NH4铵离子选择电极 上海般特仪器有限公司；PHS-3E数显pH计 上海精密科学仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 江阴市保利科研器械有限公司；ME204E 分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；TS100 微型旋涡混合仪 杭州瑞诚仪器有限公司；DHG-9070A鼓风干燥箱 上海慧泰仪器制造有限公司；GL21M高速冷冻离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；ZXJP-A1430 霉菌培养箱 上海智诚分析仪器制造有限公司；TIM840自动电位滴定仪 雷迪美特公司；A300 全自动氨基酸分析仪 德国曼默博尔公司。

1.4 试验方法

1.4.1 主要工艺流程

按GB 18186-2000《酿造酱油》的方法进行发酵，以1∶0.5(豆粕干重∶水重)充分润湿豆粕1 h后在121 ℃的高压蒸汽灭菌锅内蒸煮15 min并冷却。随后将面粉(豆粕干重的25‰)与米曲霉曲精(豆粕干重的0.3‰)混合拌曲，保温培养下定时翻曲并于44 h后出曲。成曲按照大曲重∶水重(1∶2.5)与22%(W/W)的盐混合均匀后，得到盐水浓度为16%的酱醪。一部分酱醪先在4 ℃冰箱中进行发酵初期(9 d)的低温胁迫发酵，然后放在25 ℃的恒温发酵箱中进行保温发酵(简称为LT组)；另一部分为对照组，始终保持25 ℃恒温发酵(简称为Control组)。酱醪发酵总周期为60 d，定时间隔取样，以8000 r/min冷冻离心20 min 后过滤得到酱醪样的上清液并于4 ℃低温贮存待测[7,8]。

1.4.2 pH值的测定

用pH计直接监测酱醪酿造初期pH值的变化。

1.4.3 谷氨酰胺酶活力和蛋白酶活力的测定

参考崔春等和Nannipieri等的方法，采用离子选择电极法测定谷氨酰胺酶活力。参照商业行业标准SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》，采用福林酚法测定蛋白酶活力[9,10]。

1.4.4 总氮的测定

参照国标GB 18186—2000《酿造酱油》，采用凯氏定氮法测定样品中的总氮含量。

1.4.5 氨基酸态氮的测定

参照国标GB 18186—2000《酿造酱油》，采用甲醛滴定法测定氨基酸态氮含量。

1.4.6 总酸的测定

参照国标GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》，采用中和滴定法测定总酸含量。

1.4.7 总糖的测定

参照国标GB/T 15672—2009《食用菌中总糖含量的测定》，采用苯酚硫酸法测定总糖含量。

1.4.8 游离氨基酸含量的测定

参照国标GB 5009.124—2016 《食品中氨基酸的测定》测定酱醪样品中的游离氨基酸含量。用磺基水杨酸法处理待测样品1 h，以10000 r/min 离心15 min后过滤并用微滤膜(0.22 μm)处理。使用液相离子交换柱(TS263，MembraPure，流速60 μL/min)分离氨基酸后用茚三酮显色，除脯氨酸检测波长在440 nm外，其余氨基酸均在570 nm处检测，采用外标法计算氨基酸浓度[11,12]。

1.4.9 感官评价分析

采用定量描述分析(QDA)法[13,14]。品评小组包括7名男性和5名女性(年龄25～45岁)，测评前对每位感官分析人员进行培训以提高测评结果的可靠性。感官测评的标准溶液共5种：甜味(蔗糖，1%)、咸味(氯化钠，0.7%)、鲜味(谷氨酸钠，0.35%)、苦味(L-异亮氨酸，0.5%)和酸味(柠檬酸，0.08%)。感官评价的结果采用九点线性标度法，0～9分(依次为无感觉、阈值感觉、感觉微弱、感觉中等、感觉强烈)，测评结果用雷达图进行表征。

1.5 数据分析

试验结果以两组发酵样的平均数±标准差来表示，每次试验3次平行，使用SPSS 16.0、OriginPro 9.0和Excel 2016软件分析所得试验数据并绘制图表。

2 结果与讨论

2.1 酱醪酿造初期pH值的变化

酱醪酿造过程中的pH值变化会影响酱醪体系的整体酶活力，进而影响酱油成品的品质[15]。酱醪酿造初期pH值的变化见图1。

图1 不同酿造工艺下酱醪酿造初期pH值的变化Fig.1 Changes of pH values of soy sauce mash under different brewing process at the early stage

pH呈现出不断下降的变化趋势，但不同酿造工艺下酱醪样品pH的下降速率存在着明显的差异。发酵的1～4 d，pH值下降速度较为缓慢，pH值大小始终保持LT组>Control组，且差异显著。随着发酵时间延长，发酵的5～9 d，pH的下降速度加快，pH值大小仍保持LT组>Control组，但两者差异进一步拉大。到发酵的第9天，LT组的pH值降至6.40，而Control组的pH值降至5.90。

酱醪发酵初期pH值下降的主要原因是微生物的生长代谢及其酶系的复杂生化反应。在低温胁迫发酵工艺下，酱醪的pH值始终高于传统工艺发酵酱醪的pH值。中性或弱酸性的酶系(如谷氨酰胺酶、中性蛋白酶等)可以更充分地发挥作用，对原料中的蛋白质进行分解，从而提高氨基酸、总氮和氨氮的生成率。

2.2 酱醪酿造初期谷氨酰胺酶活力和蛋白酶活力的变化

谷氨酰胺酶及蛋白酶是酱油酿造过程中的关键酶。谷氨酰胺酶可以酶解L-谷氨酰胺生成鲜味氨基酸(L-谷氨酸)，蛋白酶可以将原料中的蛋白质分解成小分子的肽类，而小分子肽类可进一步被丰富的微生物酶系(如酸性蛋白酶等)分解成氨基酸以达到增鲜、改善风味的效果[16-18]。因此，谷氨酰胺酶活力和中性蛋白酶活力是衡量酱油成品品质的重要指标之一。

图2 不同酿造工艺下酱醪酿造初期谷氨酰胺酶活力和蛋白酶活力的变化Fig.2 Changes of glutaminase activity and protease activity of soy sauce mash under different brewing process at the early stage

由图2(a)可知，两组酱醪样品的谷氨酰胺酶活力均随着发酵时间的延长先急速下降后缓慢下降，LT组>Control组且两者差异显著(P<0.05)。发酵1～5 d，两组的谷氨酰胺酶活力均迅速下降，但低温胁迫组(LT组)的酶活力明显高于对照组(Control组)，且降幅更大。5 d后，两组的酶活力下降幅度变缓且差值减小。低温胁迫发酵下的酱醪pH下降比较慢，这有利于保持酶的活力，延缓酶活力下降的速率。此外，低温胁迫发酵下容易出现菌丝体自溶的现象，从而破坏菌体细胞使残存在菌体内的谷氨酰胺酶释放出来并发挥其作用[19,20]。

由图2(b)可知，由于两组样品源于相同的成曲，因此0 d的中性蛋白酶酶活力一致，均为1349.5 U/g。不同酱醪发酵工艺下酱醪发酵初期的中性蛋白酶均呈现急速下降后缓慢下降的趋势，且两者的降幅差异较小。从第2天起，中性蛋白酶就开始缓慢下降，在第9天时，LT组蛋白酶活力为564.3 U/g，约为初始的1/2～1/3。LT组的中性蛋白酶活力始终高于Control组，这很可能与酱醪发酵初期低温胁迫有关，低温胁迫发酵下的酱醪pH较高且温度低，有利于保持蛋白酶的活力和稳定性，延缓酶活力下降的速率[21]。

2.3 酱油成品的基本理化指标

不同酿造工艺下发酵60 d的酱油成品的理化指标见表1，总氮、氨氮、总酸和总糖含量是衡量酱油产品的重要质量指标。低温胁迫组与对照组的总氮含量分别是1.79和1.78，差异不显著(P>0.05)，这与Wu等人的报道一致，说明酱醪发酵温度不是影响最终酱油产品总氮含量的重要因素。此外，除两组酱油成品的pH、总酸含量有显著性差异以外，其他理化指标如总氮、氨氮、总糖均没有显著性差异(P>0.05)。但是两组样品的总氮、氨氮均达到了特级酱油的标准(总氮≥1.50 g/dL，氨氮≥0.80 g/dL)。低温胁迫组酱油成品的pH值略高于对照组，这更有利于谷氨酰胺酶和蛋白酶等酶类发挥作用，促进鲜味及其他风味物质的产生。

表1 不同酿造工艺发酵60 d后酱油成品的理化指标Table 1 The physicochemical indexes of soy sauce products after 60 days’ fermentation under different brewing process

注：结果均为平均值±标准偏差(n=3)；表中同行标注不同字母表示具有显著性差异(P<0.05)。

2.4 酱油成品的游离氨基酸组成

氨基酸是酱油的重要营养组成部分，游离氨基酸的味道、含量高低和百分含量组成影响着酱油的风味，一定程度上反映了酱油品质的优劣。不同酿造工艺发酵60 d后酱油成品的游离氨基酸组成见表2。根据不同氨基酸呈味特性的不同，可大体将氨基酸分成甜味、鲜味、苦味和无味四类。低温胁迫组(LT组)的甜味氨基酸(1679.21 mg/mL)含量和鲜味氨基酸(1500.42 mg/mL)含量显著高于对照组(Control组)的甜味氨基酸(1669.56 mg/mL)和鲜味氨基酸(1445.57 mg/mL)含量，而苦味氨基酸(2625.82 mg/mL)含量显著低于对照组(Control组)的苦味氨基酸(2698.11 mg/mL)含量。这说明低温胁迫发酵工艺有利于提高酱油成品的甜味和鲜味，并降低苦味。同时，两组的无味类氨基酸含量和总氨基酸含量没有明显的差异。酱油的鲜味主要来源于酱油成品中谷氨酸，游离的谷氨酸主要是由谷氨酰胺酶水解谷氨酰胺产生的[22]。低温胁迫组(LT组)样品的谷氨酸(Glu)含量显著高于对照组(Control组)，这与酱醪发酵初期低温胁迫组的谷氨酰胺酶活力显著高于对照组密切相关。因此，低温胁迫发酵工艺有助于酱油成品的增甜、增鲜，进而提高酱油成品的品质。

表2 不同酿造工艺发酵60 d后酱油成品的游离氨基酸组成分析Table 2 The composition analysis of free amino acids of soy sauce products after 60 days’ fermentation under different brewing process mg/mL

注：结果均为平均值±标准偏差(n=3)；表中同行标注不同字母表示具有显著性差异(P<0.05)。

2.5 酱油成品的滋味感官分析

不同酿造工艺发酵60 d后酱油成品的滋味感官分析结果见图3。两种不同酿造工艺下酱油成品的感官分析结果差异显著，尤其是鲜味指标。低温胁迫组(LT组)的鲜味和厚味明显高于对照组(Control组)，酱油的厚味是指口感的丰富度、连续性，可以协调酱油的整体口感。低温胁迫组(LT组)的咸味稍弱于对照组(Control组)，可以使味道更温和协调，从而突出鲜味。同时，两者的甜味、苦味较弱且无明显差异。因此，酱醪酿造初期低温胁迫发酵的酱油相对于传统工艺酿造的酱油滋味更加浓郁、鲜美。

图3 不同酿造工艺下发酵60 d酱油成品的感官分析Fig.3 Sensory analysis of soy sauce products after 60 days’ fermentation under different brewing process

3 结论

酱醪酿造初期的低温胁迫工艺对酱油pH值的影响很大，低温胁迫可以延缓pH值的下降，使酱醪处于中性或弱酸性，更有利于发挥微生物和酶系的作用，从而促进更多鲜味氨基酸的产生。

不同酿造工艺下酱醪的谷氨酰胺酶、中性蛋白酶活力差异显著(P<0.05)。随发酵时间的延长，谷氨酰胺酶和蛋白酶活力均不断降低。但低温胁迫发酵有利于保留酶活力，促进曲霉菌丝体自溶释放更多谷氨酰胺酶，使原料分解得更充分。

不同酿造工艺下酱油成品的总氮、氨氮和总糖含量无显著差异。总氮、氨氮均达到了特级酱油的标准(总氮≥1.50 g/dL，氨氮≥0.80 g/dL)。而低温胁迫发酵组(LT组)的总酸含量较对照组(Control组)低。

酱醪酿造初期的低温胁迫工艺对酱油成品的游离氨基酸含量影响很大，显著提高了鲜味氨基酸和甜味氨基酸的比例，降低了苦味氨基酸的比例，有助于提高酱油品质。

酱醪酿造初期的低温胁迫工艺突出了酱油的鲜味和厚味，使得到的酱油成品更加浓郁醇厚。