郭磊，孙琪，保瑞景，谭大聪，华燕，阚欢

(1.西南林业大学 云南森林资源培育与利用协同创新中心，昆明 650224；2.西南林业大学 生命科学学院，昆明 650224)

美味牛肝菌(BoletusedulisBull. Fr.)是一种世界范围内分布的著名的野生菌，兼具食药用经济价值[1,2]。中国是美味牛肝菌的主要分布区域, 尤其在云南分布广泛[3]。美味牛肝菌含有丰富的蛋白质、还原糖和氨基酸等营养物质，其中呈鲜味的天门冬氨酸和谷氨酸占总氨基酸含量的25.4%[4,5]。美味牛肝菌还含有多糖、黄酮和多酚等生物活性成分，而多酚是一类具有多个酚羟基的次生代谢产物，对人体健康有着许多有益的作用，如对阿尔茨海默病、心血管疾病和改善肠道微生物菌群等的保护作用[6-8]，近年来已成为研究热点。芒果皮多酚、花椒多酚、甘蔗多酚、生姜多酚、百里香多酚等植物多酚[9-13]的提取及抗氧化研究已有报道，但关于美味牛肝菌多酚的研究还鲜有报道，这不仅限制了美味牛肝菌多酚的生物活性研究，也限制了美味牛肝菌资源特别是功能性调味料的开发应用。

本研究以美味牛肝菌试验对象，以多酚提取率为试验指标，考察了液料比、乙醇体积分数、提取时间、提取温度及提取次数对多酚提取率的影响，并在此基础上进行响应面优化美味牛肝菌多酚的最佳提取工艺，为美味牛肝菌多酚资源及功能调味料的开发利用提供了一定的理论基础和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

美味牛肝菌：购自云南易门县康源菌业有限公司；没食子酸、福林酚、碳酸钠、无水乙醇：以上均为分析纯。

UV-VIS 300紫外分光光度计 美国赛默飞世尔科技有限公司；BAS2245电子天平 德国赛多利斯集团；HH-2数显电子恒温水浴锅 金坛市丹瑞电器厂；3K15低温离心机 德国西格玛公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的制作

参照侯玉艳的方法略微修改[14]。准确量取浓度为0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL没食子酸溶液0.5 mL，分别加入2.5 mL 0.2 mol/L福林酚试剂摇匀后避光静置5 min，再加入2.0 mL 7.5% Na2CO3溶液摇匀静置1 h后在765 nm处测定吸光值，同时以蒸馏水为空白。以没食子酸浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为：Y=18.56C+0.015，R2=0.995。

1.2.2 美味牛肝菌多酚的提取

美味牛肝菌子实体经干燥、粉碎、过筛后备用。以多酚提取率为试验指标，采用单因素试验，研究液料比(mL/g)、乙醇体积分数(%)、提取时间(min)、提取温度(℃)及提取次数对多酚提取率的影响。影响多酚提取率的因素设以下水平：固定乙醇体积分数50%，提取时间 90 min，提取温度50 ℃，提取2次，考察不同的液料比20，25，30，35，40 (mL/g)对多酚提取率的影响；固定液料比35 (mL/g)，提取时间90 min，提取温度50 ℃，提取2次，考察不同乙醇体积分数(45%、50%、55%、60%、65%)对多酚提取率的影响；固定液料比35(mL/g)、乙醇体积分数50%、提取温度50 ℃、提取2次，考察不同提取时间(30，60，90，120，150 min)对多酚提取率的影响；固定液料比35 (mL/g)、乙醇体积分数50%、提取时间90 min、提取2次，考察不同提取温度(35，40，45，50，55 ℃)对多酚提取率的影响；固定液料比35(mL/g)、乙醇体积分数50%、提取时间90 min，提取温度45 ℃，考察不同提取次数(1，2，3次)对多酚提取率的影响。

1.2.3 多酚含量的测定

多酚提取液经抽滤后按照1.2.1的方法测定吸光值，计算出美味牛肝菌多酚的提取率。

提取率(%)=[(C×V×n)/(m×1000)]×100。

(1)

式中：C为美味牛肝菌提取液中多酚的浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；n为稀释倍数；m为美味牛肝菌质量，g。

1.2.4 响应面优化试验设计

在单因素试验结果的基础上，选取对美味牛肝菌多酚提取率影响较大的因素液料比(A，mL/g)、乙醇体积分数(B，%)、提取时间(C，min)和提取温度(D，℃)，每个因素设置3个水平，利用Box-Behnken响应面设计方法，试验因素水平设置见表1。

使用数据分析软件Design Expert 8.0.6进行数据分析，通过F检验对试验数据进行方差分析以评价模型的统计意义并进行验证试验。

2 结果与分析

2.1 响应面回归模型的建立及分析

在单因素试验结果的基础上，采用Box-Behenken试验设计原理，选取液料比(A)、乙醇体积分数(B)、提取时间(C)和提取温度(D)为自变量，美味牛肝菌多酚提取率(Y)为响应值，设计四因素三水平响应面试验。响应面试验设计方案与数据处理结果见表2。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface experiment

续 表

采用Design Expert 8.0.6对所得数据进行回归分析，回归结果分析见表3，对4个因素进行回归拟合后，得到回归方程：

Y =1.34+0.050A+0.031B-0.013C+0.0065D+0.025AB+0.0045AC-0.014AD+0.016BC+0.0095BD+0.0050CD-0.062A2-0.049B2-0.030C2-0.054D2。

(2)

对回归方程进行方差分析，结果见表3。

表3 回归模型及方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

续 表

注：“*”代表显著，P<0.05；“**”代表非常显著，P<0.01。

由表3可知，该模型显著(P<0.05)，失拟项不显著(P>0.05)。通过模型的回归方差分析结果可以看出，一次项中液料比(A)对多酚提取率的影响非常显著(P<0.01)，乙醇体积分数(B)对多酚提取率的影响显著，而提取时间(C)和提取温度(D)对多酚提取率的影响不显著。二次项A2和D2对多酚提取率的影响非常显著，B2对多酚提取率的影响显著。交互项对多酚提取率的影响均不显著。由P值可知，各因素对美味牛肝菌多酚提取率影响的大小顺序为：液料比(A)>乙醇体积分数(B)>提取时间(C)>提取温度(D)。

2.2 响应面分析

液料比、乙醇体积分数、提取时间和提取温度对美味牛肝菌多酚提取率影响的响应面图见图1。

图1 两因素间交互作用对多酚提取率的响应面图Fig.1 Response surface plots of interaction of two factors on extraction rate of polyphenols from Boletus edulis

图1分别反映了液料比和乙醇体积分数、液料比和提取时间、液料比和提取温度、乙醇体积分数和提取时间、乙醇体积分数和提取温度、提取时间和提取温度对美味牛肝菌多酚提取率的交互影响效应。由图1可知，响应面图都比较陡峭，说明美味牛肝菌多酚的提取率随其中任意两个变量的增加均呈现上升趋势。

2.3 验证试验

对回归方程(1)求解，即美味牛肝菌多酚提取率达到最大值的工艺条件为：液料比37.44 (mL/g)、乙醇体积分数57.20%、提取时间88.06 min、提取温度45.16 ℃、提取2次，在此条件下多酚的提取率为1.36%。为方便实际操作将试验条件调整为液料比37 (mL/g)、乙醇体积分数57%、提取时间90 min、提取温度45 ℃，提取2次、通过验证得出美味牛肝菌多酚的平均提取率为1.33%，与理论值相差0.03%，与模型预测值相近，说明该回归模型与实际试验过程匹配程度高，可以有效地优化美味牛肝菌多酚的提取工艺。

3 结论

在单因素试验结果的基础上，选择影响美味牛肝菌多酚提取率的4个因素(液料比、乙醇体积分数、提取时间、提取温度)为自变量，采用四因素三水平响应面设计优化多酚的最佳提取工艺。通过验证试验得出在液料比37(mL/g)、乙醇体积分数57%、提取时间90 min、提取温度45 ℃、提取2次的条件下，美味牛肝菌多酚的提取率达到1.33%±0.02%。研究结果为美味牛肝菌多酚及功能性调味料的资源开发利用提供了一定的理论依据。