陈梦玲，蓝蔚青*，李函笑，任智楚，芦子萱，谢 晶*

（上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，食品科学与工程国家级实验教学示范中心（上海海洋大学），上海 201306）

牛至（Origanum vulgare）为唇形科多年生草本植物，其在地中海地区、北非、北美与亚洲均有分布，全草可提精油[1]。牛至精油为一种淡黄色透明液体，其含有30多种化合物，主要活性成分为酚类物质与萜烯类物质[2]。这些活性成分的表面活性与脂溶性较强，使其易透过细胞膜对菌体造成损伤，从而抑制菌体生长或将其杀死[3]。近年来，关于牛至精油在水产品保鲜中的应用研究也逐见报道。如杜云飞等[3]将牛至精油作为抗菌剂，分别加入至乙烯-乙烯醇共聚物和聚乙烯，通过挤出流延制备成2 种食品保鲜膜，发现使用添加过牛至精油的保鲜膜包装黑鱼片，其脂质氧化速率降低，微生物生长受抑制。郑宗林等[4]将牛至精油添加至红罗非鱼饲料中，经过20 周的养殖发现，添加牛至精油饲料能使冷藏鱼片中肠杆菌和大肠菌群数显著降低，且货架期较对照组延长2 d；van Haute等[5]也报道牛至精油处理可使三文鱼的冷藏货架期显著延长，且能明显抑制大肠杆菌与乳酸菌生长。

水产品在流通期间，其鲜度与品质极易下降，微生物是导致其腐败变质的主因。现有研究发现，在腐败过程中，只有极少种类的特定腐败菌参与这一过程并产生不可接受异味[6]。这些适合生存、繁殖并产生腐败臭味代谢产物的菌群则为该产品的特定腐败菌[7]。因此，如何延缓水产品品质劣变、延长其贮藏货架期、抑制由于微生物繁殖而引起的腐败变质，现已成为科研工作者普遍关注的热点。腐生葡萄球菌（Saprophytic staphylococcus）作为水产品的特定腐败菌，为葡萄球菌属非致病性革兰氏阳性菌。本课题组前期通过生理生化鉴定腐败鲳鱼中的优势腐败菌为腐生葡萄球菌[8]，其在肉制品贮藏过程中会分泌蛋白酶和脂酶，使脂肪分解、蛋白质水解，产生腐败代谢产物，影响产品品质[9]。传统化学防腐剂在使用过程中会产生一定副作用，甚至癌变，对人体造成不可逆损害，这也促使安全可靠的天然生物防腐剂得到更大程度利用[10]。牛至精油的广谱抑菌性与不易产生耐药性的特点，使其在食品工业领域具有很好的开发利用前景，而其对菌体作用机制的研究更会为牛至精油的后期应用提供依据[11-12]。其中，王倩等[13]研究了银杏叶提取液对腐生葡萄球菌的作用机制，结果表明腐生葡萄球菌经银杏叶提取液处理6 h后，菌体变形且胞间黏结，其主要通过对菌体细胞膜和细胞壁的破坏实现其抑菌效果。本实验采用琼脂平板打孔法通过抑菌圈直径确定牛至精油对腐生葡萄球菌的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），由微生物生长曲线、电导率、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性、紫外物质吸收与扫描电子显微镜观察来综合评价牛至精油对腐生葡萄球菌的抑制作用机制，以期为牛至精油作为生物保鲜剂应用于水产品保鲜领域提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

腐生葡萄球菌（Saprophytic staphylococcus）为课题组前期从腐败鲳鱼中分离、筛选并鉴定后保存的菌株。

牛至精油（产地：摩洛哥；提取部位：植株；生产工艺：蒸馏法；主要成分为香芹酚（39.45%）、对伞花烃（21.05%）、百里香酚（14.55%））购于上海雅琪实业有限公司，使用前置于阴凉干燥处存放。

AKP测试盒、LDH测试盒 南京建成生物工程研究所；胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth，TSB）培养基、胰蛋白胨大豆琼脂（tryptic soy agar，TSA）培养基、氯化钠、无水乙醇、戊二醛（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Centrifuge 5810R型冷冻离心机 德国Eppendorf公司；BCD-256KF型冰箱 青岛海尔股份有限公司；ZQZY-70B型振荡培养箱 上海知楚仪器有限公司；LS-3750型灭菌锅 日本SANYO公司；Synergy2型自动酶标仪 美国BioTek公司；DDB-11A型电导率仪杭州齐威仪器有限公司； Mira 3型扫描电子显微镜捷克Tescan公司；M334712型全自动微生长曲线分析仪芬兰Bioscreen公司；UV-2450型紫外-可见分光光度计日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

将牛至精油以体积分数25%乙醇溶液为溶剂混合配制成不同体积分数备用。腐生葡萄球菌菌种在TSB液体培养基中活化2～3 代后，吸取100 μL菌液涂布在TSA固体培养基中，37 ℃恒温培养箱中培养24 h，重复平板划线。挑取活化后的腐生葡萄球菌单菌落在TSB培养基中37 ℃培养8 h，用灭菌生理盐水将其配制成含菌数106～107CFU/mL菌悬液备用。

1.3.2 MIC的测定

MIC的测定参考Dutra等[14]的方法，并稍作修改。采用打孔法测定抑菌圈直径，从而得到牛至精油对腐生葡萄球菌的MIC。吸取100 μL对数期菌悬液均匀的涂布于TSA固体培养基表面，并在平板中央进行打孔，采用二倍稀释法分别吸取8%（体积分数，下同）、4%、2%、1%、0.5%、0.25%牛至精油100 μL加入孔内；用不添加牛至精油菌液作为空白组，以25%乙醇溶液为对照组。将各组置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h后用游标卡尺测量抑菌圈直径。每个实验做3 个平行，按抑菌直径大小划分相对敏感度[15]。参考苏萌萌等[16]的方法测定牛至精油对腐生葡萄球菌的MIC（其中MIC值为明显抑制腐生葡萄球菌生长的最低体积分数）。

1.3.3 微生物生长曲线的测定

采用Diao Mingming等[17]的方法，并稍作修改。取对数期菌液，按1%接种量分别加入MIC与2 MIC牛至精油至无菌TSB培养基中，置于37 ℃、150 r/min摇床培养24 h，由全自动微生物生长曲线分析仪每隔1 h自动取样测定OD600nm值，以不添加牛至精油的菌液作为空白组，以添加25%乙醇溶液的培养液为对照；以培养时间为横坐标，OD600nm为纵坐标，绘制腐生葡萄球菌在不同条件下的微生物生长曲线。

1.3.4 电导率的测定

参考Yan Feilong等[18]的方法，并稍作修改，分别将MIC与2 MIC的牛至精油添加至1%接种量的TSB实验菌液中，置于摇床37 ℃、150 r/min培养。分别于0、2、4、6、8、10、12 h取培养液测定其电导率，以此来确定菌体金属离子的泄漏情况。以不添加精油的培养液作为空白组，以添加25%乙醇溶液作为对照组。每组样品设3 个平行。

1.3.5 AKP活力的测定

腐生葡萄球菌按1%接种量在含有MIC与2 MIC牛至精油的TSB培养液中接种，置于摇床37 ℃、150 r/min培养12 h，分别于0、2、4、6、8、10、12 h取样2 mL，置于离心机中4 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清液，按AKP测试盒说明书的方法测定胞外AKP活力。以不添加精油组作为空白，添加25%乙醇溶液作为对照组，每组实验设3 个平行。

1.3.6 牛至精油对腐生葡萄球菌细胞膜通透性的影响

1.3.6.1 紫外吸收物质的泄漏情况测定

参考Chen等[19]的方法测定牛至精油对腐生葡萄球菌紫外吸收物质的影响。将牛至精油分别加入待测菌株培养液中，使其终浓度为MIC与2 MIC，再将其置于37 ℃、150 r/min摇床中振荡培养，分别于0、2、4、6、8、10 h取样，再4 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清液通过紫外分光光度计测定菌体上清液在260 nm波长处的吸光度，每组实验设3 个平行。

1.3.6.2 LDH活力的测定

LDH在细胞质中存在并参与细胞的糖酵解途径，在细胞膜受损时会泄漏至胞外[20]。将牛至精油分别加入待测菌株培养液中，使其终浓度为MIC与2 MIC。置于摇床37 ℃、150 r/min振荡培养，分别于0、6 h取样，4 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清液并按照LDH测试盒的方法进行测定。以未经精油处理的菌株培养液为空白，25%乙醇溶液替代等体积的精油作为对照组，每组实验设3 个平行。

1.3.7 菌体微观结构的测定

参考Xu Jianguo等[21]的方法测定牛至精油处理后菌体的微观结构。取对数期菌种按1%接种量接种于含MIC、2 MIC牛至精油TSB溶液中培养，以不添加牛至精油的TSB培养液作为空白组，于摇床37 ℃、150 r/min培养6 h后，取一定量的菌液于4 000 r/min、4 ℃离心10 min，弃去上清液，菌体用pH 7.4的磷酸盐缓冲液洗涤3 次，并用体积分数2.5%戊二醛溶液于4 ℃冰箱中固定4 h，将样品分别用不同体积分数（30%、50%、70%、90%、100%）乙醇梯度脱水后，置于－80 ℃冰箱冷冻保存4～8 h，冷冻干燥机干燥24 h后涂至金属箔片并固定喷金，置于扫描电子显微镜下观察菌体形态结构。

1.4 数据处理与分析

由SPSS 13.0软件进行平均值与方差分析，实验数据均采用平均值±标准差表示，用Origin 8.5软件绘制曲线。

2 结果与分析

2.1 牛至精油对腐生葡萄球菌的MIC

表1 牛至精油对腐生葡萄球菌的抑菌效果Table 1 Inhibitory effect of OEO on Saprophytic staphylococcus

由表1可知，随着牛至精油体积分数的增加，其对腐生葡萄球菌作用效果也愈明显。当牛至精油的体积分数为8%时，表现为极敏感；牛至精油的体积分数为0.25%时，表现为低敏感；而25%乙醇溶液对腐生葡萄球菌无抑制作用，表明25%乙醇溶液对牛至精油的抑菌效果不产生影响。低敏感时牛至精油的最小体积分数为0.25%，因此，牛至精油对腐生葡萄球菌的MIC为0.25%。

2.2 牛至精油对腐生葡萄球菌生长的影响

图1 牛至精油处理对腐生葡萄球菌生长曲线的影响Fig. 1 Effect of OEO on the growth curve of Staphylococcus saprophyticus

由图1可以看出，空白组与对照组菌株保持S型曲线正常生长，培养2 h后进入对数期，在10 h后进入稳定期，可见25%乙醇溶液对腐生葡萄球菌的生长无抑制作用。而经MIC牛至精油处理后，腐生葡萄球菌进入对数期生长时间延至4 h；2 MIC牛至精油处理后，菌体进入对数期延至10 h，说明牛至精油处理可延缓腐生葡萄球菌进入对数期，达到其抑菌目的。Park等[22]研究发现，月桂酸处理能抑制金黄色葡萄球菌进入对数期；蓝蔚青等[23]在研究复合保鲜剂对金黄色葡萄球菌的抑菌效果时也得到类似结论。

2.3 牛至精油对腐生葡萄球菌培养液电导率的影响

图2 牛至精油处理对腐生葡萄球菌电导率的影响Fig. 2 Effect of OEO on electric conductivity of Staphylococcus saprophyticus

细胞膜对菌体的正常生长具有保护作用，当菌体在受到抑菌物质的伤害或在不良环境下生长时，细胞膜渗透性会有所改变，且电解质会渗漏到细胞外，导致细菌培养液电导率增加[24]。由图2可知，经过牛至精油处理的菌液的电导率显著高于空白和对照组，且牛至精油的体积分数与电导率呈正相关。由此可知，牛至精油对腐生葡萄球菌的作用呈剂量依赖性，这与生长曲线的结果一致，可能由于菌体经牛至精油处理后，其细胞膜的通透性有所增加，使菌体内电解质如K+、Ca2+泄漏至胞外，这与李婷等[25]的研究结果相似。

2.4 牛至精油处理对腐生葡萄球菌胞外AKP活力的影响

细胞壁可有效防止外来物质如抗生素、抑菌剂等进入细胞内，AKP存在于细胞膜与细胞壁间，对生物体内物质代谢起着重要作用，因此其活力是反映细胞壁完整度的重要指标之一。当菌体正常生长时，AKP活力无法在胞外检出，反之亦然。因此，可通过检测细胞外AKP的活力来判断菌体细胞壁的完整性与通透性[26]。

如图3所示，牛至精油处理后腐生葡萄球菌胞外的AKP活力明显上升，且在2 h后对照组的AKP活力稳定，而处理组样品的AKP活力显著高于对照组。在经牛至精油处理4 h后，MIC与2 MIC牛至精油处理组的AKP活力分别为0.85 U/L与1.09 U/L，这同电导率、生长曲线的测定结果相一致，进一步反映牛至精油可使菌体的细胞壁完整性遭到破坏。Hu Wei等[27]研究发现山苍子精油对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的细胞壁也起到破坏作用，可使菌液AKP活力显著提升。

2.5 牛至精油对腐生葡萄球菌细胞膜通透性的影响

2.5.1 紫外吸收物质的泄漏情况

细菌细胞膜的功能包括渗透屏障、物质转运、能量代谢，其正常的结构与功能是细菌正常生长的基本前提[28]。菌体内的核酸与蛋白质类物质在260 nm波长处有强吸收峰，通过培养液中此类物质在260 nm波长处吸收峰的强弱可判定菌体细胞膜的通透性[29]。

图4 牛至精油处理对腐生葡萄球菌膜通透性的影响Fig. 4 Effect of OEO on the membrance permeability of Staphylococcus saprophyticus

从图4可看出，随着处理时间的延长，处理组培养液在260 nm波长处的吸光度逐渐上升，且2 MIC牛至精油处理组的吸光度显著高于MIC处理组，表明牛至精油体积分数越高，其对细胞膜的破坏越严重；而未经牛至精油处理的空白组与25%乙醇溶液处理组的吸光度无明显变化。可能由于腐生葡萄球菌经精油处理后，其菌体的细胞膜完整性被破坏，核酸、蛋白质等大分子由于菌体细胞膜通透性的增加而渗透到胞外。张赟彬等[30]研究肉桂精油对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的作用机制时也发现，随着精油浓度的升高，菌体内核酸与蛋白质类物质的泄漏增加；Wang Yue等[31]研究肉桂皮精油对牙龈卟啉单胞菌的抑菌效果时也得到相似结论。

2.5.2 胞外LDH活力

图5 牛至精油处理对腐生葡萄球菌胞外LDH活力影响Fig. 5 Effect of OEO on extracellular LDH activity of Staphylococcus saprophyticus

LDH参与细胞的糖酵解途径，其存在于细胞质中，当细胞膜受到损伤时会泄漏至胞外[32]。从图5可以看出，当腐生葡萄球菌经过精油处理6 h后，MIC、2 MIC处理组培养液中的LDH活力分别从0 h的2.91、3.67 U/g升至6 h的17.59、18.67 U/g。而空白和对照组明显低于牛至精油处理组，反映出牛至精油对菌体细胞膜的损伤作用，其能使菌体内核酸等生物大分子外泄，营养物质丧失，从而达到抑菌与杀菌的目的，本结果与紫外吸收结果一致。

2.6 微观结构观察结果

图6 腐生葡萄球菌经牛至精油处理6 h后扫描电子显微镜图Fig. 6 SEM graphs of Staphylococcus saprophyticus after treatment with OEO for 6 h

由图6可知，空白组的腐生葡萄球菌外观光滑、平整饱满。而经牛至精油处理后，菌体外观形态变粗糙，有凹痕存在，尤其在菌体两端较为明显；经过MIC牛至精油处理后，菌体出现胞膜破裂、凹陷现象，部分菌体畸形，细胞壁膜褶皱，有裂纹，甚至剥落；而经2 MIC牛至精油处理后，菌体大量胞膜剥落，且破裂畸形，细胞受损严重。说明牛至精油对菌体结构的破坏程度与其体积分数呈正相关，可能由于牛至精油是一类脂溶性物质，其通过结合细胞膜在膜内形成孔道进入细胞内，同时与胞内活性物质相互作用，而对菌体细胞结构造成破坏，导致其死亡。Silva等[33]发现茶树精油对单增李斯特菌的细胞形态也产生类似损害；Dutra等[34]得出牛至精油能对脂环酸芽孢杆菌造成破坏而达到抑菌目的；Bhargava等[35]发现牛至精油能对大肠杆菌与鼠伤寒杆菌的细胞结构造成破坏，使其细胞膜破裂而达到抑菌目的。

3 结 论

绿色、健康、纯天然的食品添加剂已成为当今时代的主流，而牛至精油作为一种植物天然提取物，因其良好的抗氧化性、独特风味与较强抑菌性逐渐成为新型食品防腐剂的首选对象。本研究得出牛至精油对腐生葡萄球菌的MIC为0.25%，且经牛至精油处理后的菌体细胞内容物大量外泄至胞外，说明牛至精油会使菌体细胞壁、细胞膜的通透性与完整性遭到破坏，由于牛至精油的脂溶性特点，也使其更好地与菌体细胞膜表面结合，能在胞膜内形成孔道，使其中的疏水性活性物质与菌体内的活性物质相互结合，影响细胞的正常代谢，从而抑制其生长；牛至精油对菌体结构的破坏程度与其体积分数呈正相关。牛至精油对菌体遗传物质影响与菌体蛋白质组学表达仍需深入研究。本研究为牛至精油作为食品工业新型抑菌剂提供了理论参考。